李有強 張云燕 劉楊 張軒 蔡雪瑩 陳茶 羅燕芬

1南方醫(yī)科大學附屬何賢紀念醫(yī)院檢驗科（廣州511400）；2廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科（廣州501180）；3廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院（廣州510006）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種常見的條件致病菌，目前臨床通過細菌分離培養(yǎng)與生化反應鑒定PA，此方法操作復雜，耗時較長［1-2］。尋找簡單快速的診斷項目對PA 感染有重要的臨床價值。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）與感染性炎癥的發(fā)生發(fā)展有關［3］，可在血清中被檢測，可作為感染性疾病的診斷血清學標志物［4-5］。PA 分泌的信號分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型絲氨酸內酯（N-3-oxododecanoy1-L-homoserine lactone，3-O-C12-HSL）可阻礙單核細胞衍生樹突細胞（monocytes derived dendritic cells，Mo-DCs）成熟，參與PA 的致?。?］。同時，通過lncRNA 芯片實驗發(fā)現3-O-C12-HSL 處理的Mo-DCs 中，lncRNA ENST00000420480 變 化 顯 著，提示lncRNA-ENST00000420480 參與PA 感染過程。參與致病的lncRNA 往往可作為疾病診斷和預后生物標志物。本文旨在探討血清中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480 在PA 感染中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 材料Trizol、PRIM 1640 和胎牛血清（Life，Carlabad，CA），96 孔細胞培養(yǎng)板、6 孔細胞培養(yǎng)板（Corning，NY）、384 孔平底微量反應板（Life，Carlabad，CA）、8 聯PCR 反應管、50 mL 無菌離心管、15 mL 無菌離心管、1.5 mL EP 管（Corning，NY）。

1.2 方法

1.2.1 分離人單核細胞取表觀健康人全血100 mL，EDTA-K2 抗凝，密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，磁珠用前渦旋混勻，按每3 × 107個細胞50 μL 磁珠的量加入抗人CD14+磁珠，室溫孵育30 min。用PBS 調整磁珠標記后的細胞濃度為1 × 107～8 × 107個細胞/mL，置于磁力架上，靜置10 min，小心吸去上清。

1.2.2 誘導培養(yǎng)Mo-DCs 與分組分選的CD14+細胞加入含10%胎牛血清的PRIM 1640 完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基中加入重組人粒-單細胞集落刺激因子和重組人白介素4，終濃度分別為100 ng/mL，重懸后按2 × 106/mL 鋪6 孔板。第5天獲得未成熟MO-DCs，分三組進行培養(yǎng)：0.1%DMSO 的PBS 組（陰性對照組），0.1 μg /mL 的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）組（模型組）和0.1 μg /mL 的LPS+25 μmol/L 的3-O-C12-HSL 組（實驗組）。

1.2.3 樣本的收集實驗組納入標準：經細菌鑒定卡判定為PA。排除上呼吸道定植菌污染，痰涂片經革蘭染色為下呼吸道合格痰標本（白細胞＞25 個/每高倍視野同時上皮細胞＜10 個/每低倍視野）且細菌培養(yǎng)未見其他致病菌。收集受試者確診當天送檢紅色干燥管或黃色分離膠管，1 500 rpm 離心20 min 分離血清，-80 ℃保存。對照組納入標準：體檢表觀健康人，無急慢性炎癥，無肝炎，梅毒，艾滋等傳染性疾病。收集當天送檢紅色干燥管或黃色分離膠管，1 500 rpm 離心20 min 分離血清，-80 ℃保存。

1.2.4 提取Mo-DCs 和血清中RNARNA 提取采用Trizol 法。收集培養(yǎng) 的Mo-DCs，每2 × 106個細胞加入1 mL 的Trizol。另外，血清樣本為每0.2 mL加入0.8 mL 的Trizol。室溫靜置10 min 后加入等體積氯仿，震蕩渦旋后室溫靜置5 min，4 ℃下12 000 r/min 離心30 min，吸上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃下12 000 r/min 離心30 min。 棄上清，加入乙醇洗滌后室溫干燥，加入20 μL 去RNA 酶水。

1.2.5 qRT-PCR 檢測Mo-DCs 和血清lncRNAENST00000420480 表達量參照TaKaRa 逆轉錄試劑盒說明書（codeNo.RP047A）反轉錄，按TaKa-Ra SYBR RT-PCR 試劑盒說明書進行操作。lncRNA-ENST00000420480 引物：5′-AAGCAAATCGCATTCCAAAC-3′，5′-TACCTTCACCCTCCCAGCAC-3′；β-actin 引物：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。lncRNAENST00000420480 相對定量的計算方法使用2-△△Ct法，qRT-PCR 反應內參為β-actin（ACTB）。在Applied Biosystems ViiA ?7 實 時 定 量PCR 儀 進 行擴增。

1.3 統計學方法采用SPSS 11.0 繪制ROC 曲線，確定lncRNA-ENST00000420480 的診斷臨界值及該處診斷指標的特異性和敏感性，計算曲線下面積（AUC）和約登指數（YI），評估lncRNAENST00000420480 的診斷效能。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3-O-C12-HSL調節(jié)Mo-DCs 中l(wèi)ncRNAENST00000420480 表達為明確3-O-C12-HSL 對Mo-DCs 中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480 的影響，qRTPCR 實驗發(fā)現PBS 組相對表達量（2.04 ± 0.18），LPS 組相對表達量為1.00，3-O-C12-HSL 實驗組相對表達量為（1.42 ± 0.13）。不同組間差異有統計學意義（F= 50.86，P ＜0.05）。LPS 下調Mo-DCs 中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480 表達（P＜0.05），3-O-C12-HSL 上 調Mo-DCs 中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480 表達（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Mo-DCs 中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480 的表達水平Fig.1 The expression of lncRNA-ENST00000420480 in Mo-DCs

2.2 lncRNA-ENST00000420480 在PA 感染患者中的表達水平為明確PA 感染患者中l(wèi)ncRNAENST00000420480 的表達水平，qRT-PCR檢測21例PA 感染患者及32 例健康人血清中l(wèi)ncRNAENST00000420480的表達量。患者年齡28 ～91歲，平均（69.8.1 ± 13.4）歲；健康體檢者年齡34 ～89歲，平均（65.0 ± 5.0）歲，見表1。PA 感染組中血清lncRNA-ENST00000420480 相對表達量為（3.85± 4.18），正常組中血清的相對表達量為（1.30 ±1.06）。PA 感染組高于正常組，差異具有統計學意義（t= 19.50，P＜0.05）。

表1 受試者的一般資料Tab.1 The general data of subjects

2.3 lncRNA-ENST00000420480對PA 感染的診斷效能分析為明確血清中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480的相對表達量在PA 感染中的診斷效能，繪制ROC 曲線，見圖2。 AUC 為0.708（95%CI：0.557～0.860），具有較好的診斷價值（P= 0.01）。相對表達量4.13，其診斷靈敏度與診斷特異度分別為42.9%和100%，YI為0.429，診斷效能最好，表明PA感染的血清學最佳診斷截點為4.13。

3 討論

圖2 血清lncRNA-ENST00000420480 診斷PA 感染的ROC 曲線Fig.2 The ROC curve of serum lncRNA-ENST00000420480 for diagnosis of PA infection

血清中l(wèi)ncRNA 可作為多種疾病的診斷和預后標志物［7-8］。筆者前期發(fā)現在PA 分泌的信號分子3-O-C12-HSL 阻礙Mo-DCs 成熟過程中，lncRNAENST00000420480 發(fā)生特征性改變，與PBS 組相比，LPS 組下調4.9 倍，3-O-C12-HSL 組上調1.65 倍，提示LncRNA-ENST00000420480 參與PA 的致病。為此，筆者通過qRT-PCR 驗證3-O-C12-HSL 阻礙Mo-DCs 成熟過程中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480表達水平，發(fā)現Mo-DCs 中，LPS 下調lncRNAENST00000420480 表達水平，3-O-C12-HSL 上調lncRNA-ENST00000420480 表達水平。

LncRNA-ENST00000420480 是一種天然反義RNA，由基因反義鏈轉錄、與編碼鏈反向互補，以轉錄后調控的方式調控編碼和非編碼基因的表達和功能。生物信息學分析發(fā)現LncRNAENST00000420480 序列與雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）存在基因重疊區(qū)，提示LncRNA-ENST00000420480 作用的靶分子為mTOR。mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，mTOR 信號通路介導細胞代謝、生長、增殖和炎癥反應等多種細胞功能的調節(jié)［9-10］。mTOR 信號通路調節(jié)樹突細胞的功能，發(fā)揮抗炎作用［11］。本研究發(fā)現促炎因子LPS 下調LncRNA-ENST00000420480表達，抗炎因子3-O-C12-HSL 可上調LncRNA-ENST 00000420480表達，與預期結果相符。

本研究通過比較21 例臨床PA 感染患者血清及32 例健康人血清中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480的表達量，發(fā)現銅綠假單胞菌PA 感染患者血清中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480 高于正常人2.95 倍［（3.85±4.18）vs.（1.30±1.06），P=0.002］，具有較好的診斷價值。當相對表達量為4.13，其靈敏度與特異度分別為42.9%和100%，YI為0.429，診斷效能最好，表明PA 感染的血清學最佳診斷點值為lncRNA-ENST00000420480 相對表達量4.13。

綜上所述，通過實時熒光定量PCR 證實3-OC12-HSL 上 調Mo-DCs 中LncRNA-ENST00000420480表達，lncRNA-ENST00000420480 在PA 感染患者血清中表達升高。PA 是社區(qū)獲得性肺炎的常見病原菌，檢測血清中l(wèi)ncRNA-ENST00000420480 的濃度水平有望成為一種簡單、快速的方式診斷PA感染。