胡山 孫威 鄧豫 李樊 孔康樂 趙波

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胸外科（武漢430030）

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最常見原因之一［1-2］。目前肺癌治療的各種臨床進(jìn)展主要包括手術(shù)切除和化療，已取得了一定的成果［3-4］。然而晚期肺癌的預(yù)后極差，主要是由于腫瘤轉(zhuǎn)移。針對腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)之一［5］。人Kruppel 樣 因 子3（Krüppel-like factor 3，KLF3）是Krüppel 樣因子家族的一員，在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出異常表達(dá)。研究表明KLF3 在人轉(zhuǎn)移性肉瘤中失調(diào)表達(dá)，并且敲低KLF3 促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［6］。在結(jié)腸癌中，二代RNA 測序分析表明KLF3 可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮保護(hù)作用［7］。然而KLF3 介導(dǎo)的調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不明確，KLF3 在肺癌中的作用也尚不清楚。本文以非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞A549 及H1299 為研究對象，以KLF3 敲減慢病毒作為實(shí)驗(yàn)工具，擬研究KLF3 在臨床肺癌組織中的表達(dá)水平，并探索其在肺癌轉(zhuǎn)移中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和細(xì)胞培養(yǎng)TRIzol 試劑獲自上海Invitrogen 公司。A549 和H1299 購自上海生物研究所，并在補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中于37 ℃在含5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。KLF3 敲減病毒系統(tǒng)和陰性對照病毒系統(tǒng)購自廣州銳博生物有限公司。從美國CST 公司獲得抗KLF3、E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白的抗體，抗體Vimentin、Zo-1和GAPDH 的抗體購自美國Abcam 公司。

1.2 蛋白質(zhì)印跡使用臨床組織標(biāo)本或總細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，所述組織或細(xì)胞裂解物在NP40［150 mmol/L NaCl，0.1% SDS，1% NaMoO4，1%NP40，50 mmol/L Tris-HCL（pH7.5）和0.02% NaN3］緩沖液中用蛋白酶和磷酸酶抑制劑裂解。通過SDS-PAGE 凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美國Millipore 公司）上。將條帶與一抗在4 ℃孵育過夜后將條帶與辣根過氧化物酶（HRP，武漢博世德公司）標(biāo)記的二抗孵育1 h。然后通過ECL 試劑（Thermo Scientific）檢查信號。

1.3 RNA 分離和定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）用TRIzol 試劑從臨床組織標(biāo)本中或細(xì)胞中提取總RNA。然后，用PrimeScript RT 試劑盒（TAKARA 公司）合成cDNA。用SYBR Green Master Mix（TAKARA 公司）進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）。以GAPDH 為內(nèi)參基因。用2-△△CT法測定相對表達(dá)數(shù)據(jù)。在此使用以下引物進(jìn)行qRT-PCR 測定：GAPDH 基因：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′（正向），5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′（反向）；KLF3基因：5′-TGTCTCAGTGTCATACCCATCT-3′（正向），5′-CCTTCTGGGGTCTGAAAGAACTT-3′（反向）；E-鈣粘蛋白基因：5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′（正向），5′-GGGTGTCGAGGGAAA AATAGG-3′（反向）；Vimentin 基因：5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′（正向），5′-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′（反向）；ZO-1 基因：5′-CAACATACAGTGACGCTTCACA-3′（正 向），5′-CACTATTGACGTTTCCCCACTC-3′（反向）；N-鈣粘蛋白基因：5′-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3′（正向），5′-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG -3′（反向）。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建體和穩(wěn)定細(xì)胞系KLF3 的shRNA序列購自Sigma-Aldrich。使用pGKO.1-嘌呤霉素載體構(gòu)建所有實(shí)驗(yàn)中使用的ShKLF3。使用亂序載體作為陰性對照。對于慢病毒生產(chǎn)，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）將PLKO.1-shRNAKLF3載體，包裝質(zhì)粒（pCMV-dr8.Z dvpr）和包膜（pCMVVSV-G）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中。72 h 后，用病毒顆粒感染肺癌細(xì)胞。通過在含有2 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞2 周來選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系。

1.5 免疫組化染色及細(xì)胞免疫熒光檢測人肺癌標(biāo)本及相鄰的正常標(biāo)本取自我院胸外科。使用IHC 法檢查KLF3 的表達(dá)。使用免疫熒光法檢測上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)。每個(gè)招募者獲得知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。所有樣品儲存在液氮中備用。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 測定劃痕實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種到六孔板中，密度為90%，24 h 后，用200 μL 移液管尖端制備傷口。然后，在游離血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在不同時(shí)間點(diǎn)觀察傷口愈合距離。transwell 遷移測定：將細(xì)胞接種到用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的上室中。下室充滿補(bǔ)充有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。溫育24 h 后，以4%甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。transwell 侵襲測定：將細(xì)胞接種到用基質(zhì)凝膠（BD Biosciences 公司）預(yù)處理的上室中，并且用補(bǔ)充有10% FBS 的完全培養(yǎng)基填充下室。圖像由顯微鏡拍攝。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及制圖。數(shù)據(jù)表示為均值± 標(biāo)準(zhǔn)差。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肺癌中KLF3 表達(dá)減少首先檢測人正常組織和肺癌組織中的KLF3 表達(dá)。與正常組織相比，KLF3 的蛋白質(zhì)水平在肺癌中明顯下降（圖1A）；進(jìn)一步檢查上述組織中KLF3 的mRNA 水平，KLF3 的mRNA 水平在肺癌組織中也明顯下降（圖1B）。接下來，通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，肺癌腫瘤組織中KLF3 表達(dá)水平降低（圖1C）。

2.2 敲低KLF3 促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲本研究通過慢病毒感染建立了表達(dá)shRNA-KLF3 的穩(wěn)定細(xì)胞系，在H1299 和A549 細(xì)胞中通過蛋白質(zhì)印跡和qPCR 測定沉默效率（圖2A、2B）。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，敲低KLF3 在傷口愈合測定中顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移（圖2C、2E），3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果見圖2D、2F。與這些結(jié)果一致，在Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)中，敲低KLF3 顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞中的遷移（圖3A），H1299 細(xì)胞：ShKLF3 組（215 ± 23）個(gè)/視野，ShNC 組（171 ± 11）個(gè)/視野；A549 細(xì)胞：ShKLF3組（82 ± 19）個(gè)/視野，ShNC 組（51 ± 7）個(gè)/視野（圖3B、3C）；在Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)中，敲低KLF3 也明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞中的遷移（圖3D），H1299 細(xì)胞：ShKLF3 組（52 ± 10）個(gè)/視野，ShNC 組（22 ± 5）個(gè)/視野；A549 細(xì)胞：ShKLF3 組（25± 6）個(gè)/視野，ShNC 組（8 ± 3）個(gè)/視野（圖3E、3F）。

圖1 人肺癌中KLF3 表達(dá)減少Fig.1 Reduced expression of KLF3 in human lung cancer

2.3 KLF3 沉默促進(jìn)肺癌的EMT轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的進(jìn)展。EMT 被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移級聯(lián)中的重要步驟，并且使細(xì)胞具有遷移和侵襲能力。首先筆者通過蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)觀察到敲減KLF3 后，與對照細(xì)胞相比，間充質(zhì)標(biāo)記型蛋白表達(dá)顯著上升，而代表細(xì)胞上皮表型的基因表達(dá)下降（圖4A）。進(jìn)一步的qPCR 實(shí)驗(yàn)中，上述細(xì)胞中各種EMT 相關(guān)基因的mRNA 水平也有相同趨勢的變化（圖4B）。本研究通過普通光學(xué)顯微鏡觀察不同處理后的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)shRNA-KLF3 細(xì)胞與對照細(xì)胞相比明顯表現(xiàn)出間充質(zhì)表型，如細(xì)胞的形態(tài)變得更類似于梭形，細(xì)胞周偽足增多，細(xì)胞間間隙變大（圖4C）。更重要的是，免疫熒光測定提示ShKLF3 細(xì)胞表達(dá)比對照細(xì)胞更多的間充質(zhì)標(biāo)記物（圖4D）。

3 討論

圖3 敲低KLF3 促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲Fig.3 Knockdown of KLF3 promotes migration and invasion of lung cancer cells

圖4 KLF3 沉默促進(jìn)肺癌的EMTFig.4 KLF3 Silencing Promotes EMT of Lung Cancer

轉(zhuǎn)移是肺癌患者預(yù)后不良的主要原因。EMT是上皮癌細(xì)胞失去細(xì)胞連接和浸潤血管以轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處區(qū)域的關(guān)鍵因素［8-9］。闡明參與轉(zhuǎn)移的異常信號傳導(dǎo)途徑將為治療肺癌提供潛在的治療靶點(diǎn)。EMT 是腫瘤轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的重要機(jī)制之一。越來越多的文獻(xiàn)表明這種細(xì)胞表型的變化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極其特別的作用［10-11］。在這項(xiàng)研究中，已經(jīng)證明了KLF3 在肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 過程及細(xì)胞運(yùn)動、遷移及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制；此外，在肺癌組織中發(fā)現(xiàn)KLF3 表達(dá)降低。因此，靶向KLF3 的療法與當(dāng)前的治療策略相結(jié)合，可能作為肺癌轉(zhuǎn)移的有效治療方法。

最近的報(bào)道［12］顯示，KLFs 家族因素在腫瘤的發(fā)展中起著重要作用。例如，在結(jié)腸癌中觀察到KLFs 表達(dá)下調(diào)，更有趣的是，在家族性腺瘤性息肉病患者的腺瘤中發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)水平降低，表明KLFs 在癌癥中下調(diào)可能作為預(yù)后監(jiān)測的生物學(xué)標(biāo)志物。既往的研究表明，多種KLFs 因子確實(shí)與轉(zhuǎn)移有關(guān)［13］。例如，過表達(dá)KLF4 通過調(diào)節(jié)caveolin-1 表達(dá)抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移［14］。值得注意的是，YAN 等［15］的研究也清楚地表明KLF8 通過轉(zhuǎn)錄激活FHL2 促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，我們進(jìn)一步檢查了KLF3 和EMT 水平的關(guān)聯(lián)，表明KLF3 的敲減伴隨著間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的明顯升高。此外，本研究評估了對照細(xì)胞和ShKLF3 細(xì)胞之間運(yùn)動、遷移和侵襲的能力。與對照細(xì)胞相比，ShKLF3 細(xì)胞中觀察到運(yùn)動、遷移和侵襲的能力均明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，敲低KLF3 能夠促使肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 的表型變化，從而更容易從原發(fā)灶脫離，進(jìn)入血管發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在本研究中的數(shù)據(jù)提示了KLF3 是肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，KLF3介導(dǎo)細(xì)胞EMT、促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移。

總之，本研究表明KLF3 在調(diào)節(jié)肺腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用。本研究的數(shù)據(jù)表明，KLF3 表達(dá)與臨床中的肺癌發(fā)展密切相關(guān)，敲低KLF3 介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控與EMT 相關(guān)。更重要的是，本研究為肺癌中的KLF3 信號通路提供了新的見解，提示KLF3 可能作為預(yù)后不良的診斷標(biāo)志物，也可能是肺癌轉(zhuǎn)移患者的潛在治療靶點(diǎn)。