尹學(xué)敬 楊占輝

河北省衡水市人民醫(yī)院1產(chǎn)科，2介入科（河北衡水053000）

子癇前期（preeclampsia，PE）是臨床上常見的一種妊娠期并發(fā)癥，在妊娠20 周后出現(xiàn)以初發(fā)高血壓及蛋白尿?yàn)橹饕卣鞯陌Y狀，可分為輕度PE和重度PE。PE 的發(fā)病率約為5% ～8%，是孕婦和新生兒死亡的主要原因之一［1］。PE 發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，目前在臨床早期尚無有效的標(biāo)志物或者檢測指標(biāo)來預(yù)測并改善疾病預(yù)后。因此，尋找能夠預(yù)測疾病進(jìn)展的檢測指標(biāo)對于緩解PE 的進(jìn)展改善孕婦和新生兒結(jié)局具有重要意義。MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，其包含19 ～22 個堿基，主要通過堿基互補(bǔ)配的原則與于靶mRNA 的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA 降解或翻譯抑制從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究［2］發(fā)現(xiàn)miRNA 的表達(dá)與腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年研究［3-5］表明，microRNA與PE 發(fā)生明顯相關(guān)，且miRNA 血清學(xué)檢測是一種經(jīng)濟(jì)、簡單、有效的診斷方法，可以此作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。miR-423-5p 和miR-204-5p 是發(fā)現(xiàn)較早的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA，但是miR-423-5p和miR-204-5p 在PE 的發(fā)病中的研究較少。近來，有文獻(xiàn)［6-7］分別報道，miR-423-5p 在PE 早期孕婦胎盤組織和血清中表達(dá)升高，miR-204-5p 在妊高癥患者血清中［8］和在PE 患者胎盤組織中表達(dá)升高［9］。因此，筆者推測，血清中miR-423-5p 和miR-204-5p水平檢測可能與PE 的發(fā)生發(fā)展及結(jié)局有關(guān)。本研究對79 例PE 患者進(jìn)行血清miR-423-5p 和miR-204-5p 水平聯(lián)合檢測，分析其與PE 發(fā)病的關(guān)系、診斷價值和預(yù)后判斷，以期為PE 臨床診斷提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年10月至2018年9月于我科定期行產(chǎn)前檢查并分娩的PE 孕婦79 例，按照第8 版《婦產(chǎn)科學(xué)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)分為輕度PE 組（40 例）和重度PE 組（39 例）。另選取同期正常孕婦100 例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20 ～40 歲，產(chǎn)檢孕周20 ～28 周，所選孕婦均為單胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有高血壓、冠心病、糖尿病、慢性腎炎和自身免疫病等；（2）嚴(yán)重的肝腎功能不全、心功能不全；（3）既往有前置胎盤、胎盤早剝、流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)研究對象入院后記錄入院年齡、孕齡，測量血壓，均由專業(yè)婦產(chǎn)科醫(yī)師或護(hù)士完成。常規(guī)指標(biāo)：抽取靜脈血檢測血常規(guī)，24 h 尿蛋白：PE 患者留取24 h 尿液，自排空膀胱后開始計(jì)時。留取尿液前先清潔外陰，將留取尿液置入清潔的容器內(nèi)，病情嚴(yán)重者留置導(dǎo)尿管留取標(biāo)本，全部尿液混勻后送檢驗(yàn)科，測定24 h 尿蛋白。儀器設(shè)備：應(yīng)用日本Sysmex 型血球計(jì)數(shù)儀分析血常規(guī)；樣本血液生化指標(biāo)的檢測采用日立7600-020型全自動生化分析儀；使用羅氏Cobas 8000 全自動生化分析儀測定24 h 尿蛋白水平。對患者進(jìn)行追蹤、隨訪，完善患者終止妊娠時的孕周時間、血壓情況及新生兒體質(zhì)量情況等數(shù)據(jù)資料。

1.3 血清miRNA 的提取和miR-204-5p和miR-423-5p 表達(dá)水平檢測靜脈血10 mL，4 ℃1 600 ×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個新的2 mL 無酶離心管中，4 ℃16 000 ×g再次離心10 min，吸取上層血清轉(zhuǎn)移到新的2 mL 無酶離心管中，即為處理好的血清標(biāo)本，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩iRNeasy Serum/Plasma Kit（德國Qiagen公司）提取小RNA，在紫外分光光度計(jì)上測濃度，然后將濃度均調(diào)整為1 μg/μL；利 用miRNeasy Serum/Plasma Spike-In control（德國Qiagen 公司）進(jìn)行標(biāo)化；利用miScriptⅡReverse Transcription Kit（德國Qiagen 公司）將小RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；利用miScript SYBR Green PCR Kit（德國Qiagen 公司）進(jìn)行Real time PCR，檢測血清中的miR-204-5p 和miR-423-5p 的表達(dá)水平。qPCR 反應(yīng)引物序列見表1；PCR 反應(yīng)條件：為預(yù)變性95 ℃15 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，70 ℃30 s，擴(kuò)增40 個循環(huán)。所有樣品均做3 個平行孔，循環(huán)數(shù)取其均數(shù)。每個樣品目的基因的Ct 用加入的外參基因線蟲cel-miR-39 來標(biāo)化，從而校正加入的RNA 量，ΔCt目的基因= Ct目的基因-Ctcel-miR-39，分別獲得兩組每個標(biāo)本的ΔCt 值，2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)水平，即miR-204-5p和miR-423-5p表達(dá)水平。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用K-S 法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料用（）表示；非正態(tài)計(jì)量資料采用M（Q1，Q3）表示，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示。多組計(jì)量資料比較如服從正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析，若方差不齊或非正態(tài)分布用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)和Mann-whitney 兩兩比較；變量間相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析；構(gòu)建受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線評價miR-423-5p 和miR-204-5p 的診斷價值。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較各組孕婦年齡、孕齡、收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。輕度PE 組與重度PE 組的收縮壓、舒張壓24 h 尿蛋白明顯高于對照組（P＜0.05），且重度PE 組顯著高于輕度PE 組（P＜0.05）。輕度PE組與重度PE 組孕齡顯著高于對照組（P＜0.05）；輕度PE 組與重度PE 組新生兒體質(zhì)量顯著低于對照組，而輕度PE 組與重度PE 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 3 組間相關(guān)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of related indicators among three groups M（Q1，Q3）

2.2 3 組血清miR-423-5p 和miR-204-5p 水平qRT-PCR 檢測miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者及對照組中的差異表達(dá)，結(jié)果提示與對照組比較，miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者中的表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-423-5p 和miR-204-5p 在重度PE 組表達(dá)高于輕度PE 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 患者血清中的表達(dá)Fig.1 Expression of serum miR-423-5p 和miR-204-5p in PE patients

2.3 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 表達(dá)水平與各臨床指標(biāo)與妊娠結(jié)局相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)分析表明，miR-423-5p 表達(dá)與年齡、收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白定量呈正相關(guān)關(guān)系，miR-204-5p 表達(dá)與收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白定量呈正相關(guān)，miR-423-5p 和miR-204-5p 表達(dá)均與孕齡、新生兒體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

2.4 診斷價值分析血清miR-423-5p 和miR-204-5p 對PE 進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測時曲線下面積為0.916。當(dāng)截斷值為0.48 時，診斷價值最高，其靈敏度為78.5%，特異度是96%，且聯(lián)合診斷PE 的AUC 大于單獨(dú)診斷的AUC。見表4、圖2。

3 討論

PE 是一種妊娠期特有疾病，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且病死率較高［10］，嚴(yán)重者可導(dǎo)致產(chǎn)婦子癇、心肝腎等重要臟器功能會出現(xiàn)不同程度變化，心臟衰竭等各種并發(fā)癥，胎兒生長受限和腦癱，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一［11］。因此尋找一種在疾病發(fā)生早期可靈敏診斷且對疾病病情及預(yù)后有評估作用的標(biāo)志物成為了目前臨床研究的重點(diǎn)。大量數(shù)據(jù)表明，多種疾病患者外周血中miRNA 表達(dá)譜與健康對照患者不同，且其表達(dá)具有組織特異性。但是有關(guān)PE 患者循環(huán)血中miRNA 表達(dá)的報道較少。且既往報道中，多以正常孕婦血清和PE 兩組血清中miRNA 表達(dá)失衡為研究切入點(diǎn)，而兩種miRNA 在PE 患者血清學(xué)水平聯(lián)合檢測的價值則鮮見報道。本研究重點(diǎn)探討血清miR-423-5p 和miR-204-5p 在PE 診斷中的價值及與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。

表3 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 與臨床指標(biāo)及妊娠結(jié)局相關(guān)分析Tab.3 Analysis of the correlation between serum miR-423-5p and miR-204-5p and clinical indicators or pregnancy outcomes

表4 血清miR-423-5p 和miR-204-5p 對PE 診斷價值的比較Tab.4 Comparison of diagnostic value of miR-423-5p and miR-204-5p in serum for PE

圖2 血 清miR-423-5p 和miR-204-5p 預(yù)測PE 的ROC 曲線Fig.2 ROC curve of serum miR-423-5p and miR-204-5p in predicting preeclampsia

miR-423-5p 在多種疾病中表達(dá)異常，如心衰患者循環(huán)miR-423-5p 表達(dá)升高，且與左室肥厚程度相關(guān)［12］。另外，許多研究［13］證實(shí)，miR-423-5p 在腫瘤組織中表達(dá)失調(diào)，參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。miR-423-5p在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，miR-423-5p 可抑制前列腺的腫瘤發(fā)展。而在骨肉瘤組織中，miR-423-5p 表達(dá)下調(diào)，抑制miR-423-5p 表達(dá)可以抑制骨肉瘤的增殖和侵襲［14］。近年研究［6-7］也發(fā)現(xiàn)，在PE孕婦胎盤組織和血清中miR-423-5p 表達(dá)異常，但在研究［7］中，miR-423-5p 的表達(dá)差異僅表現(xiàn)在疾病的早期。本研究結(jié)果顯示，PE 組miR-423-5p 表達(dá)水平高于對照組，與TIMOFEEVA 等［7］研究的結(jié)果一致。不同的是，本研究觀察了miR-423-5p 表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析，進(jìn)一步提示了miR-423-5p 與PE 的 相 關(guān) 性。

miR-204-5p 的抗腫瘤效應(yīng)已被廣泛證實(shí)。如在黑色素瘤細(xì)胞中，miR-204-5p 模擬物可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲［15］。miR-204-5p 可抑制肝癌細(xì)胞增殖［16］、調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移以及代謝［17］。另外，miR-204-5p 也作為血清標(biāo)志物判斷前列腺癌轉(zhuǎn)移情況［18］。目前已有研究［19］以miR-204-5p 為靶點(diǎn)治療腫瘤，得到較好的效果。近來研究［8］發(fā)現(xiàn)，妊高癥患者血清miR-204-5p 表達(dá)升高，可作為診斷預(yù)防治療的生物標(biāo)志。也有研究［9］發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 在PE 患者胎盤組織中表達(dá)明顯增高，且能夠通過下調(diào)MMP-9 的表達(dá)使滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲能力下降，與PE 的發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PE 組miR-204-5p 表達(dá)水平高于對照組，并進(jìn)一步對miR-204-5p 表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，提示了miR-204-5p 與PE 的相關(guān)性。

本研究顯示，PE 組孕婦miR-423-5p 和miR-204-5p 值顯著高于對照組，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。不僅如此相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-423-5p 和miR-204-5p 與收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白呈正相關(guān)，與孕齡和新生兒體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。血清miR-423-5p 和miR-204-5p 對PE 進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測時曲線下面積為0.916，且聯(lián)合診斷PE 的AUC 大于單獨(dú)診斷的AUC，提示了二者聯(lián)合檢測PE 患者血清診斷的價值更高。但本研究存在標(biāo)本量小的不足，結(jié)果存在一定局限性，但是對血清miR-423-5p 和miR-204-5p 用于PE 診斷、治療和預(yù)后評估具有積極的意義，因此，研究結(jié)果還需要大樣本量的數(shù)據(jù)支持，有待進(jìn)一步深入研究和探討。