田冬梅 袁李禮

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院急診科（合肥230022）；2湖南省腦科醫(yī)院心內(nèi)科（長沙410007）

阿霉素是一種臨床應(yīng)用廣泛的蒽環(huán)類抗腫瘤藥［1］，效果顯著，但其所使用過程中會造成心臟毒性效應(yīng)等不良反應(yīng)，限制其臨床應(yīng)用，嚴重影響患者的治療效果和生存質(zhì)量［2］。研究表明阿霉素化療2年內(nèi)心臟損傷的發(fā)生率超過一半［3］，心臟毒性效應(yīng)的防治是臨床和基礎(chǔ)關(guān)注的研究熱點。心脈隆注射液是美洲大蠊中分離出的一種國家二類新藥，主要用于治療慢性心力衰竭［4］，研究［5-7］報道其能具有心臟保護功能。阿霉素造成心臟毒性效應(yīng)可能與心肌凋亡有關(guān)［8］，自噬與凋亡之間存有交互調(diào)控。而心脈隆注射液對于阿霉素心臟損傷動物模型的作用機制是否與凋亡-自噬相關(guān)仍不完全明確。本研究擬觀察心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟損傷的保護作用的影響，并進一步探討其可能機制，為其用于防治臨床阿霉素心臟損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級雄性C57BL/6 小鼠30 只，體質(zhì)量（32 ± 2）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院動物實驗中心，環(huán)境溫度保持在（23 ± 2）℃，濕度維持在40% ～60%，明暗交替時間12 h/12 h。

1.2 材料和試劑心脈隆注射液購自云南騰藥制藥股份有限公司、阿霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、乳酸脫氫酶（LDH）和磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）檢測采用日立7600 型全自動生化分析儀、HE 染液和DAB 顯色試劑購自武漢谷歌生物科技有限公司、一步法TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物科技有限公司、兔抗LC3 單克隆抗體、相應(yīng)二抗購自美國Sigma公司。

1.3 動物模型與分組SPF 級雄性C57BL/6 小鼠30 只隨機分為3 組。對照組10 只：腹腔注射等體積生理鹽水7 d；阿霉素組10 只：腹腔注射阿霉素10 mg/kg 2 d+腹腔注射等體積生理鹽水5 d；心脈隆+阿霉素組10 只：腹腔注射阿霉素10 mg/kg 2 d+腹腔注射心脈隆注射液250 mg/kg 5 d。

1.4 樣本收集小鼠處理7 d 后，腹腔注射水合氯醛麻醉后心臟穿刺采血，3 000 r/min 離心收集血清，用于心肌酶學指標檢測。心肌組織收集后用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用于HE 染色、組織凋亡和自噬分析。

1.5 指標檢測

1.5.1 HE 染色將切片脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片后顯微鏡觀察。

1.5.2 心肌酶學指標檢測取200 μL 血清，通過全自動生化分析儀檢測LDH 和CK-MB 水平。

1.5.3 心肌組織凋亡檢測TUNEL 將切片脫蠟至水、修復(fù)破膜后，利用TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒檢測，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，隨機選擇10 個視野進行計數(shù)分析，計算凋亡指數(shù)（AI）= 凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)× 100%。

1.5.4 心肌組織自噬檢測將切片脫蠟至水、抗原修復(fù)后血清封閉、LC3 一抗4 ℃孵育過夜、二抗孵育、DAB 顯色復(fù)染細胞核，脫水封片后顯微鏡觀察，隨機選擇10 個視野進行計數(shù)分析。

1.6 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標準差表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行組間比較，最小顯著性差異法（LSD）進行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟組織病理的影響HE 染色結(jié)果顯示，阿霉素能導致小鼠心臟組織纖維細胞和肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂、局部炎癥細胞浸潤，心脈隆處理改善阿霉素小鼠心肌組織上述形態(tài)學變化，見圖1。

圖1 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟組織病理的影響Fig.1 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac histopathology in mice

2.2 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心肌酶學指標的影響心肌酶學指標檢測顯示，與對照組相比，阿霉素引起小鼠LDH 和CK-MB 升高（P＜0.05），心脈隆處理組小鼠LDH 和CK-MB 較阿霉素模型組降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心肌酶學指標的影響Fig.2 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced myocardial enzymes in mice

2.3 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟組織細胞凋亡的影響TUNEL 實驗顯示，正常組小鼠心臟組織細胞凋亡指數(shù)低于5%，阿霉素能夠引起小鼠心臟組織細胞凋亡指數(shù)（綠色熒光增多）（P＜0.05），心脈隆處理能夠降低阿霉素所增加的小鼠心臟組織細胞凋亡（P＜0.05），見圖3。

2.4 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟組織自噬的影響LC3 免疫組化結(jié)果顯示，正常組小鼠心臟組織自噬水平低，阿霉素能夠誘導小鼠心臟組織自噬（棕色增多）（P＜0.05），心脈隆處理能夠降低阿霉素所增加的小鼠心臟組織自噬（P＜0.05），見圖4。

圖3 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟組織細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac apoptosis in mice

圖4 心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟組織自噬的影響Fig.4 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac autophagy in mice

3 討論

阿霉素作為一種非選擇性廣譜高效化療藥物，用于多種癌癥的治療，但其臨床應(yīng)用被其嚴重的副作用限制，其中最突出的是心臟損傷。本研究制備阿霉素小鼠心臟損傷模型，結(jié)果顯示與對照組相比，阿霉素組心肌組織損傷、心肌酶學指標LDH 和CK-MB 升高（P＜0.05），提示模型制備成功；心脈隆注射液處理減輕阿霉素小鼠心肌組織損傷、降低心肌酶學指標（P＜0.05），明確了心脈隆注射液對阿霉素小鼠心臟損傷的保護作用，心脈隆可能作為臨床防治阿霉素心臟損傷的潛在藥物。

目前關(guān)于阿霉素導致的心臟損傷的機制很多，細胞凋亡對于生物體的發(fā)育及體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡中起作用［9］。阿霉素誘導的心肌細胞凋亡在心臟損傷中發(fā)揮重要作用［10］。阿霉素誘導心肌細胞凋亡的發(fā)生機制涉及多個方面［11］：（1）阿霉素誘導心肌細胞膜Fas 和FasL 表達，增加Fas/FasL 結(jié)合，激活Caspase-8 啟動凋亡；（2）阿霉素導致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，膜電位降低，細胞色素C 釋放至胞漿，激活Caspase-9 啟動凋亡；（3）阿霉素心肌細胞絲裂原活化蛋白激酶途徑，促進促凋亡基因Bax 表達，抑制抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL 表達，從而導致凋亡；（4）阿霉素增加P53 蛋白表達和心肌細胞凋亡，且不受Caspase 抑制劑的影響。抑制阿霉素誘導的心肌細胞凋亡能夠有效防止其導致的心臟損傷，本研究結(jié)果證實阿霉素能引起小鼠心臟組織細胞凋亡，心脈隆注射液處理后抑制心臟組織細胞凋亡，提示心脈隆注射液對阿霉素心臟損傷的保護作用可能與其減輕細胞凋亡相關(guān)。

自噬與凋亡之間存有交互調(diào)控，二者能被多種刺激激活、互相轉(zhuǎn)化［12］。阿霉素能影響自噬，但自噬在心肌細胞的存活和死亡中具有雙重作用。研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理所引起的自噬能對抗阿霉素的心臟毒性，利用自噬誘導劑雷帕霉素能減輕阿霉素誘導的心臟毒性［13］，適度饑餓導致的自噬同樣也能減輕阿霉素的急性心臟損傷［14］。而阿霉素所誘導的自噬則更多的與其心臟毒性相關(guān)，且呈現(xiàn)出復(fù)雜性。自噬的過程包括幾個步驟，包括自噬雙層膜結(jié)構(gòu)和自噬體的形成，自噬體和溶酶體的融合和降解。透射電子顯微鏡觀察顯示阿霉素增加心肌組織細胞中自噬體的形成和累積［15］。阿霉素能夠通過抑制溶酶體從而抑制自噬流，自噬體無法通過溶酶體降解而聚集，導致心肌細胞內(nèi)有害物質(zhì)聚積，促進心肌細胞凋亡和心臟損傷［16］。自噬抑制劑3-MA、Beclin-1 或ATG5 等自噬相關(guān)基因沉默均可對抗阿霉素的心臟損傷［17］。本研究結(jié)果顯示阿霉素能誘導小鼠心臟組織自噬，心脈隆注射液處理后能減輕心臟組織自噬，提示心脈隆注射液對阿霉素心臟損傷的保護作用可能其抑制自噬，從而減輕細胞凋亡相關(guān)。

本研究首次提出心脈隆注射液通過影響心肌細胞自噬/凋亡發(fā)揮發(fā)揮對阿霉素小鼠心臟損傷的保護作用，加強了其心臟保護作用的基礎(chǔ)實驗和理論依據(jù)，也將為臨床防治阿霉素心臟損傷方面提供了新的潛在藥物。但是本研究還具有一定的局限性，研究僅明確了心脈隆影響心肌細胞自噬/凋亡，但其具體的調(diào)控靶點還需進一步深入探討，此外，心脈隆注射液應(yīng)用于臨床阿霉素心臟缺乏相關(guān)的臨床大數(shù)據(jù)支持，仍需要開展更多的多中心臨床試驗觀察。綜上所述，心脈隆注射液能夠減輕心肌組織細胞凋亡和自噬水平，發(fā)揮對阿霉素小鼠心臟損傷的保護作用。本研究為臨床預(yù)防和治療阿霉素心臟損傷提供新的思路和實驗依據(jù)。