潘海亮，王 燦，趙 筱，王永澤，王金華*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

L-丙氨酸是人體一種非必需氨基酸，在日化、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，可以用作甜味劑、營(yíng)養(yǎng)液和蛋白質(zhì)合成原料[1]。據(jù)研究，L-丙氨酸在工業(yè)塑料領(lǐng)域上有著巨大的商業(yè)價(jià)值[2]。目前L-丙氨酸主要以葡萄糖為原料進(jìn)行發(fā)酵而獲得，這就意味著每年需要大量的小麥或玉米等糧食作物用于生產(chǎn)丙氨酸，這是與人爭(zhēng)糧的不利局面。

木質(zhì)纖維素在地球廣泛存在且可再生，其水解液中含有大量的五碳糖和六碳糖，其中主要為木糖和葡萄糖[3]。以廉價(jià)的木質(zhì)纖維素糖源為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)是近來(lái)的研究熱點(diǎn)，其關(guān)鍵是解除發(fā)酵中葡萄糖對(duì)其他碳源產(chǎn)生的分解碳代謝物阻遏效應(yīng)（carbon catabolite repression，CCR）[4]，即葡萄糖效應(yīng)（glucose effect，GE）。解除葡萄糖效應(yīng)使大腸桿菌能同時(shí)利用葡萄糖和木糖進(jìn)行生物制造的相關(guān)研究已有報(bào)道。采用菌株選育或混菌發(fā)酵方式可有效緩解葡萄糖效應(yīng)，如CORDARO J C等[5]利用磷霉素從大腸桿菌野生菌中篩選出了不通過(guò)糖類磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphatase transporter system，PTS）轉(zhuǎn)運(yùn)糖類的菌株[6]，乙醇產(chǎn)量提高了20%；EITEMAN M A等[7]通過(guò)在培養(yǎng)基中加入兩種分別只利用葡萄糖和木糖的大腸桿菌來(lái)生產(chǎn)乳酸，完全避免了葡萄糖效應(yīng)。而采用工程菌構(gòu)建方式，直接將PTS途徑相關(guān)基因進(jìn)行突變被認(rèn)為是目前解除葡萄糖效應(yīng)的主要途徑之一[8]。通過(guò)敲除PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因（glucose transporters gene，ptsG）來(lái)增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)混合糖的利用，已廣泛利用于聚羥基脂肪酸酯[9]、琥珀酸[10]、乙醇[11]和D-乳酸[12]等產(chǎn)物的發(fā)酵之中，并取得了不錯(cuò)的效果。如本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ptsG基因缺陷菌株E.coliSZ470P能同時(shí)利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇，產(chǎn)量提高了14.32%[11]，構(gòu)建的ptsG缺陷菌株E.coliJH-15也能同時(shí)利用木糖和葡萄糖[12]，且D-乳酸產(chǎn)量提高了25.86%。

本研究在前期獲得了一株高產(chǎn)丙氨酸（糖酸轉(zhuǎn)化率＞95%）的工程菌株基礎(chǔ)上，基于利用混合糖發(fā)酵丙氨酸的目的，擬通過(guò)Red同源重組（Red homologous recombinatioin）技術(shù)[13]構(gòu)建ptsG基因缺陷菌株，以減弱混合糖發(fā)酵丙氨酸時(shí)的葡萄糖效應(yīng)從而提高發(fā)酵效率，為利用木質(zhì)纖維素這種可再生的原料生產(chǎn)丙氨酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

出發(fā)菌為大腸桿菌（Escherichiacoli）基因工程菌JH-B2[2]（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔpflB：：alaD），可以高效利用葡萄糖和木糖產(chǎn)丙氨酸，由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存；E.coliJH-B3是通過(guò)Red同源重組技術(shù)獲得的ptsG基因缺陷菌株。質(zhì)粒pKD4含有包含了硫酸卡那霉素（kanamycin，Kan）抗性基因的FRT-kan-FRT閱讀框和氨芐青霉素（ampicillin，Amp）抗性基因，pKD46包含編碼Red重組系統(tǒng)的基因和Amp抗性基因[14]，兩種質(zhì)粒均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司購(gòu)得。實(shí)驗(yàn)所需引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成，引物名稱和序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增及驗(yàn)證引物Table 1 Primers used for amplification and verification

根據(jù)質(zhì)粒pKD4和ptsG的兩側(cè)基因序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物P1、P2，靠近5'端未加下劃線的序列分別與ptsG基因兩端序列同源，靠近3'端加下劃線的序列分別與質(zhì)粒pKD4上Kan基因兩側(cè)序列互補(bǔ)。又根據(jù)擴(kuò)增引物P1、P2設(shè)計(jì)了驗(yàn)證引物P3、P4，驗(yàn)證引物序列與擴(kuò)增引物上ptsG兩側(cè)各20 bp序列相同。

1.1.2 化學(xué)試劑

CaCl2·2H2O（分析純）、L-阿拉伯糖（生化試劑）、醋酸鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：香港基因有限公司；DL 20000 DNA Maker、PCR Master Mix：美國(guó)Fermentas公司；溴化乙錠（分析純）：廣州賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司；10×TE溶液、卡那霉素、氨芐青霉素：浙江Mersco工貿(mào)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertabi（LB）培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L氯化鈉，5 g/L酵母粉，20 g/L瓊脂粉。

卡那抗性篩選培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素50 mg/L。

種子培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入20g/L葡萄糖或木糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基：100 g/L葡萄糖，100 g/L木糖和100 g/L混合糖（50 g/L葡萄糖和50 g/L木糖）。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；MTV-12V6HE-R凝膠自動(dòng)成像儀：美國(guó)Major Science公司；My Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、MicroPulser電轉(zhuǎn)儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Waters e2695高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；Sartorius BB-8846880發(fā)酵罐：德國(guó)Sartorius Stedim Biotech公司；SBA-40D生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌工程菌E.coliJH-B3菌株構(gòu)建

以pKD4質(zhì)粒為模板，用擴(kuò)增引物P1、P2進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），以獲得帶有卡那抗性基因的PCR擴(kuò)增片段，然后用3 mol/L的醋酸鈉和體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇沉淀和純化卡那抗性基因PCR擴(kuò)增片段。PCR擴(kuò)增體系：無(wú)菌水22μL、模板1 μL、引物P1和P2各1 μL、PCR Master Mix 25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次。

用CaCl2法[15]將pKD46 轉(zhuǎn)化到E.coliJH-B2 細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選后以獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子E.coliJH-B2/pKD46，在氨芐平板上純化2～3代；挑取E.coliJH-B2/pKD46的單菌落至含2%L-阿拉伯糖的LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至菌液的光密度值（OD600nm值）達(dá)到0.5～0.6，將菌液轉(zhuǎn)移至已提前預(yù)冷的50 mL離心管中并置于冰上30 min；冰浴后于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，去除上清液，用已滅菌的超純水反復(fù)洗滌細(xì)胞沉淀4次，最后用轉(zhuǎn)移至1.5 mL預(yù)冷的EP管中于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，去掉上清液，并用100 μL超純水重懸；將E.coliJH-B2/pKD46的重懸菌液和10 μL卡那抗性基因PCR擴(kuò)增片段混合均勻后置于冰上20 min，再轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的電擊杯中，連接電轉(zhuǎn)儀，在2 000 V條件下電擊4～5 ms；向電擊杯中加入1 mL已預(yù)冷的無(wú)氯化鈉的LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，于30 ℃、150 r/min條件下復(fù)蘇培養(yǎng)3 h；將復(fù)蘇培養(yǎng)液涂布于含卡那霉素的LB 平板上，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為E.coliJH-B3。

1.3.2 重組菌株JH-B3的驗(yàn)證

分別以E.coliJH-B2和JH-B3的菌落為模板，用驗(yàn)證引物P3、P4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得片段，然后將兩者的PCR擴(kuò)增片段與卡那抗性基因PCR擴(kuò)增片段以及20 000 bp DNA Marker進(jìn)行電泳和凝膠成像，通過(guò)比三者條帶的大小來(lái)驗(yàn)證ptsG基因是否敲除成功。若成功，則在含卡那霉素LB固體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素）的無(wú)氧管中將E.coliJH-B3連續(xù)培養(yǎng)10代，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將菌株E.coliJH-B2和JH-B3分別在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，碳源依次為10%葡萄糖、10%木糖及10%混合糖（5%葡萄糖＋5%木糖），轉(zhuǎn)速恒定在200 r/min，發(fā)酵溫度恒定在37 ℃，發(fā)酵pH恒定在6.80，以26%的氨水為發(fā)酵中和劑。每隔固定時(shí)長(zhǎng)取樣，并檢測(cè)葡萄糖、木糖和丙氨酸含量，對(duì)比兩種菌株利用葡萄糖和木糖的能力，以及產(chǎn)丙氨酸的能力。每次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，同一發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)視為一組平行數(shù)據(jù)并取平均值。

1.3.4 分析檢測(cè)

葡萄糖：采用生物傳感儀檢測(cè)法[16]；木糖：采用高效液相色譜分析法。其色譜條件為Bio-Rad HPX 87H色譜柱（300mm×7.8mm），流動(dòng)相為4mmol/LH2SO4，流速0.4mL/min，柱溫45 ℃，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器[17]；

丙氨酸：采用高效液相色譜法。其色譜條件為依利特C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為0.05 mol/L的Na2HPO4溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.5，CH3OH和Na2HPO4溶液體積比為1∶9；流速0.80 mL/min；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，溫度30 ℃，進(jìn)樣量5 μL[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ptsG基因缺陷菌株JH-B3驗(yàn)證

ptsG基因自身長(zhǎng)度約1 434 bp，則以對(duì)照菌株E.coliJH-B2為模板通過(guò)驗(yàn)證引物P3、P4（約20bp）得到的PCR擴(kuò)增片段理論大小約為1 434 bp；FRT-kan-FRT閱讀框約1 477 bp，則以pKD4質(zhì)粒為模板通過(guò)擴(kuò)增引物P1、P2（約65 bp）得到的卡那抗性基因PCR擴(kuò)增片段理論大約為1 567 bp；當(dāng)利用同源重組將菌株JH-B2上ptsG基因置換為卡那抗性基因PCR擴(kuò)增片段而獲得菌株JH-B3后，再以JH-B3為模板通過(guò)引物P3、P4得到的PCR擴(kuò)增片段理論大小約為1 567 bp，與卡那抗性基因PCR擴(kuò)增片段相同，并與JH-B2的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相差約133 bp。分別對(duì)DNA Maker、JH-B2的PCR擴(kuò)增片段、JH-B3的PCR擴(kuò)增片段以及卡那抗性基因的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠電泳和成像，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 ptsG基因缺陷菌株JH-B3的PCR鑒定Fig.1 Identification of ptsG gene-deficient strain JH-B3 by PCR

由圖1可知，經(jīng)凝膠電泳成像后，JH-B2 的PCR擴(kuò)增片段大小約1 430 bp，JH-B3的PCR擴(kuò)增片段和卡那抗性基因的PCR擴(kuò)增片段大小約1 560 bp，兩者基本相同且與JH-B2的PCR擴(kuò)增片段相差約130 bp，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論結(jié)果基本一致，由此可知ptsG基因缺陷菌株E.coliJH-B3構(gòu)建成功。

2.2 兩種菌株利用葡萄糖的能力對(duì)比

對(duì)照菌株JH-B2和ptsG基因缺陷菌JH-B3 在分別以10%葡萄糖為碳源下發(fā)酵產(chǎn)丙氨酸情況見(jiàn)圖2。

圖2 兩種菌株利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)丙氨酸能力比較Fig.2 Comparison of alanine production fermented by two strains with glucose

由圖2可知，在菌體生長(zhǎng)方面，菌株JH-B2的生物量（OD600nm值）在發(fā)酵20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600nm值最大為7.29，而ptsG基因缺陷菌株JH-B3在28 h后進(jìn)入穩(wěn)定期且OD600nm值最大為8.26；在20 h之前菌株JH-B2的生物量高于菌株JH-B3，而20 h之后菌株JH-B3的生物量都高于菌株JH-B2。在利用葡萄糖方面，菌株JH-B2在36 h發(fā)酵結(jié)束，平均耗糖速率為2.78 g/（L·h），而菌株JH-B3在48 h發(fā)酵結(jié)束，平均耗糖速率為2.08 g/（L·h），兩者后期耗糖速率都變慢，這可能是后期丙氨酸產(chǎn)生反饋抑制導(dǎo)致的[19]。菌株JH-B3較JH-B2利用葡萄糖的平均速率降低了25.18%，發(fā)酵周期延長(zhǎng)了33.33%。在生產(chǎn)丙氨酸方面，菌株JH-B2最終生產(chǎn)丙氨酸98.7 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度2.74 g/（L·h）；JH-B3最終產(chǎn)生產(chǎn)丙氨酸98.2 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為2.05 g/（L·h），JH-B3較JH-B2的生產(chǎn)強(qiáng)度降低了25.18%。

結(jié)果表明，ptsG基因的敲除可以明顯的降低大腸桿菌攝取利用葡萄糖的能力，并且ptsG缺陷菌株JH-B3的生物量高于對(duì)照菌，這可能是因?yàn)閜tsG的敲除減少了乙酸的積累從而有利于菌體生長(zhǎng)，以及JH-B3攝取的葡萄糖較多地用于菌體生長(zhǎng)[20]，導(dǎo)致JH-B3具有更高的生物量，也導(dǎo)致了JH-B3的丙氨酸產(chǎn)量略低于JH-B2。

2.3 兩種菌株利用木糖能力對(duì)比

對(duì)照菌株JH-B2和ptsG基因缺陷菌JH-B3 在分別以10%葡萄糖為碳源下發(fā)酵產(chǎn)丙氨酸情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，在菌體生長(zhǎng)方面，在發(fā)酵48 h后菌株JH-B3和JH-B2的生物量都進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600nm值最大分別為6.3和6.42，兩者的生長(zhǎng)趨勢(shì)幾乎相同。在利用木糖方面，菌株JH-B2在216 h發(fā)酵結(jié)束，平均耗糖速率為0.46 g/（L·h）；菌株JH-B3在218 h發(fā)酵結(jié)束，平均耗糖速率為0.46 g/（L·h），兩者利用木糖情況基本相同。在生產(chǎn)丙氨酸方面，菌株JH-B2發(fā)酵最終生產(chǎn)丙氨酸89.9 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.42 g/（L·h）。JH-B3發(fā)酵最終產(chǎn)生產(chǎn)丙氨酸89.6 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.41 g/（L·h），兩者產(chǎn)丙氨酸情況也基本相同。

圖3 兩種菌株利用木糖發(fā)酵產(chǎn)丙氨酸能力比較Fig.3 Comparison of alanine production fermented by two strains with xylose

結(jié)果表明，在以木糖為唯一碳源時(shí)，敲除ptsG基因?qū)臧l(fā)酵產(chǎn)丙氨酸無(wú)明顯的影響，這是因?yàn)榇竽c桿菌內(nèi)木糖有獨(dú)立于葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝途徑，ptsG基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白只轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖而不轉(zhuǎn)運(yùn)木糖。

2.4 兩種菌株利用混合糖能力對(duì)比

在以10%混合糖（5%葡萄糖＋5%木糖）發(fā)酵時(shí)，對(duì)照菌株JH-B2和ptsG基因缺陷菌株JH-B3的菌體生長(zhǎng)情況、耗糖情況及丙氨酸產(chǎn)量見(jiàn)圖4。由圖4A可知，在24 h之前，菌株JH-B2的生物量（OD600nm值）均比菌株JH-B3大，而24 h之后菌株JH-B3的生物量（OD600nm值）反超JH-B2且始終比JH-B2大；菌株JH-B2的生物量在28 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期，最大的OD600nm值為6.58，而JH-B3的生物量在40 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，最大的OD600nm值為7.32。結(jié)果表明，ptsG基因缺陷菌株JH-B3所攝取的糖更多的用于菌體生長(zhǎng)，因而具有更高的生物量。其生長(zhǎng)趨勢(shì)與在10%葡萄糖培養(yǎng)基中相一致。

圖4 菌株JH-B2和JH-B3在混合糖中的生長(zhǎng)曲線（A）、耗糖（B）及丙氨酸產(chǎn)量（C）Fig.4 Growth curves (A),sugar consumption (B) and alanine production(C)of strain JH-B2 and JH-B3 in mixed sugar

由圖4B可知，菌株JH-B3同時(shí)開(kāi)始利用葡萄糖和木糖，發(fā)酵32 h時(shí)利用完葡萄糖，發(fā)酵至98 h利用完木糖，而菌株JH-B2利用完葡萄糖后才開(kāi)始利用木糖，發(fā)酵24 h利用完葡萄糖，發(fā)酵28 h時(shí)開(kāi)始利用木糖且至98 h還剩余18.1 g/L木糖未利用。菌株JH-B2和JH-B3消耗葡萄糖的速率分別為2.08 g/（L·h）和1.56 g/（L·h），消耗木糖的速率分別為0.33 g/（L·h）和0.51 g/（L·h）。結(jié)果表明，敲除ptsG基因在降低大腸桿菌攝取利用葡萄糖的能力同時(shí)，變向增強(qiáng)了其對(duì)木糖的攝取利用能力，使大腸桿菌在混合糖發(fā)酵中能同時(shí)利用葡萄糖和木糖，大幅地減弱了葡萄糖效應(yīng)帶來(lái)的不利影響。由圖4C可知，在發(fā)酵24 h之前，菌株JH-B2的丙氨酸產(chǎn)量都高于菌株JH-B3，這是因?yàn)樵?4 h之前，雖然菌株JH-B3同時(shí)在利用葡萄糖和木糖產(chǎn)丙氨酸，但利用木糖的速率還很慢，而菌株JH-B2雖然不能利用木糖，但利用葡萄糖產(chǎn)丙氨酸的速率卻大于菌株JH-B3利用葡萄糖和木糖產(chǎn)丙氨酸的速率之和；在發(fā)酵24 h之后，菌株JH-B3的丙氨酸產(chǎn)量卻逐漸超過(guò)菌株JH-B2，這是因?yàn)閮煞N菌株在利用完等量葡萄糖的過(guò)程中，菌株JH-B3利用木糖產(chǎn)丙氨酸的能力卻遠(yuǎn)大于菌株JH-B2；在發(fā)酵32 h之后，兩種菌株產(chǎn)丙氨酸的速率基本相同，這是因?yàn)?2 h時(shí)菌株JH-B3的葡萄糖也被利用完，兩者利用木糖的速率基本相同。發(fā)酵至98 h，菌株JH-B2丙氨酸產(chǎn)量為77.6 g/L，轉(zhuǎn)化率為94.7%，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.79 g/（L·h），而菌株JH-B3丙氨酸產(chǎn)量為94.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為94.1%，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.96 g/（L·h），菌株JH-B3的生產(chǎn)強(qiáng)度較菌株JH-B2提高了21.5%，這是因?yàn)榇藭r(shí)菌株JH-B3已經(jīng)利用完所有糖，而菌株JH-B2尚剩余18.1 g/L的木糖未轉(zhuǎn)化成丙氨酸。

3 結(jié)論

大腸桿菌在混合糖（葡萄糖＋木糖）發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)優(yōu)先攝取利用葡萄糖，待葡萄糖利用完后停滯一段時(shí)間才開(kāi)始利用木糖，這種現(xiàn)象被稱為CCR效應(yīng)，也被稱為葡萄糖效應(yīng)。因此決定混合糖發(fā)酵周期和效率的關(guān)鍵因素是菌株對(duì)木糖的利用速率。大量研究表明，葡萄糖效應(yīng)與PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)。PTS系統(tǒng)負(fù)責(zé)特異性地將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，并將其磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。PTS系統(tǒng)中的ptsG基因編碼EIICBGlc在葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化中起到重要的作用。理論上敲除ptsG基因可以降低大腸桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的速率和降低磷酸化水平，從而抑制葡萄糖效應(yīng)[21]。

本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌基因工程菌JH-B2為出發(fā)菌株，通過(guò)Red同源重組技術(shù)，敲除了磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因ptsG，得到了ptsG基因缺陷菌株JH-B3。在以10%混合糖（5%葡萄糖＋5%木糖）發(fā)酵產(chǎn)丙氨酸時(shí)，JH-B3能同時(shí)利用葡萄糖和木糖，大幅度減小了葡萄糖效應(yīng)所帶來(lái)的不利影響，其木糖利用速率和丙氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度較對(duì)照菌JH-B2的分別提高了54.5%和21.5%，并且其轉(zhuǎn)化率高達(dá)94.1%。本次實(shí)驗(yàn)為利用廉價(jià)的木質(zhì)纖維素產(chǎn)丙氨酸提供了理論基礎(chǔ)。