高麗梅，高金秀，梁蔓蔓，劉 妍，姚淑敏*

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）屬嗜熱性需氧芽孢桿菌，但兼有厭氧的特性，為革蘭氏陽性（G+）菌，芽胞孔雀綠著色。國標GB 18281.3—2015《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物指示劑第3部分：濕熱滅菌用生物指示劑》中將G.stearothermophilus作為濕熱滅菌用生物指示劑。嗜熱脂肪土芽孢桿菌之所以可以在嚴苛的條件下生長，與細胞膜的結構和流動性以及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關[1-2]。此外嗜熱性也可能與菌體內(nèi)存在著某種染色體外遺傳因子有關，但還有待進一步地研究和證實。目前，對嗜熱脂肪土芽孢桿菌的研究主要集中在某些特定的酶的研究[3-5]。但針對這些嗜高溫特性是否與該菌產(chǎn)生熱穩(wěn)定性酶和胞膜的特殊性質(zhì)有一定相關性，這種酶是什么樣的酶，這種膜具有什么樣的特殊構造等問題均需要作深入的研究。

熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）33是氧化還原分子伴侶家族的主要成員，熱休克反應導致各種熱休克蛋白的迅速產(chǎn)生，從而保護細胞免受不利環(huán)境對細胞生長的影響[6-8]。Hsp33最初是從研究大腸桿菌（Escherichia coli）熱休克蛋白時發(fā)現(xiàn)，后又在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)，并在保護細胞免受脅迫過程中起著重要的作用[9]。Hsp33被廣泛認為是細胞蛋白質(zhì)構象和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換的重要介質(zhì)[10]。在細菌中，特定的感官分子能夠感知溫度波動并將這種波動轉(zhuǎn)變成細胞間的信號進行傳遞。這種熱傳感器，包括核酸（脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA））和蛋白質(zhì)。細菌一旦感知到應激信號，就會調(diào)用特定的分子機制來控制編碼熱休克蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄[11]。CHUANG S E等[12-13]研究了大腸桿菌在熱和氧脅迫條件下的熱休克反應，結果表明，Hsp33在大腸桿菌處于熱和氧化環(huán)境條件時，其表達量顯著增加，而缺乏Hsp33基因的細菌，在遇到這些應激條件時，表現(xiàn)非常敏感。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中Hsp33蛋白構象的變化影響其抗脅迫功能，Hsp33蛋白通過鋅離子的釋放，導致C端和連接區(qū)展開，并形成活性二聚體，從而阻止有害蛋白質(zhì)聚集體的形成[14-15]，有效的抵御外界脅迫。近來的研究主要集中在大腸桿菌的Hsp33的結構和作用機制[16-17]的研究，對嗜熱脂肪土芽孢桿菌中Hsp33基因的研究尚鮮見報道。

本課題旨在對嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）GL-1的Hsp33基因進行克隆，利用相關軟件對其表達的蛋白結構進行分析。同時，考察熱脅迫處理對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1生長的影響，并利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）研究菌株在熱脅迫中Hsp33基因的表達情況，從而初步了解Hsp33基因在菌株的嗜熱過程中的作用。為進一步了解該菌株的嗜熱性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）GL-1：分離自死海的海水中，保存于本實驗室；DH5α感受態(tài)：北京索萊寶科技公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良的LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 50 g/L，瓊脂18 g/L，pH值7.0。0.1 MPa、121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。液體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.1.3 試劑

質(zhì)粒pET28a、細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、One Step RT-PCR Kit：索萊寶生物技術有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I（10 U/μL），BamH I（10 U/μL）：日本TaKaRa公司；信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）提取試劑盒：上海澤葉生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Nanodrop OneC微量DNA檢測儀：美國thermofisher有限公司；T100 PCR儀：美國Bio-Rad公司；THZ-C-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海之信儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；HH-4水浴鍋：上海力辰儀器科技有限公司；DYCP-32A型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一生物科技有限公司；GelDo XR+凝膠成像系統(tǒng)：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

取100 μL保藏的嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1涂布于改良LB培養(yǎng)基，40 ℃條件下培養(yǎng)24 h。挑取單菌落劃線于改良LB培養(yǎng)基，40 ℃條件下培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于含有50 mL改良LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，40 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 菌株DNA的提取及PCR擴增

將培養(yǎng)12 h的發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心，收集菌體，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取DNA，用微量DNA檢測儀在波長260 nm處檢測提取結果。根據(jù)已知菌株的Hsp33基因，設計相應引物，上游引物為5'-CGCGGATCCATGAGTGACTACTTAGTC-3'（下劃線部分為EcoR I酶切位點），下游引物為5'-CCGGAATTCTTATATAGCTTCTTCTTTCAT-3'（下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點）。以嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1的DNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水補充至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次；72 ℃再延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收柱純化后用EcoRI、BamHI進行雙酶切，純化，與質(zhì)粒pET-28a連接，通過電轉(zhuǎn)化導入感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 Hsp33蛋白的結構分析

使用美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）對Hsp33蛋白進行保守序列分析。采用在線軟件ExPASy（http：//www.expasy.org/tools/）中的Prot Param和Prot Scale程序?qū)sp33蛋白的氨基酸組成、數(shù)目、相對分子質(zhì)量及親疏水性等進行分析。使用在線軟件DNA MAN對Hsp33蛋白的氨基酸序列進行比對分析。運用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）對Hsp33蛋白的卷曲螺旋位置進行分析。采用Signal P4.1對Hsp33蛋白的信號肽進行分析。采用在線軟件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）對Hsp33蛋白的α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角結構以及無規(guī)則卷曲等進行分析預測。使用在線軟件Pymol（https：//pymol.org/）對Hsp33蛋白的三級結構進行分析。

1.3.4 菌株的熱激處理

將嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1接種于改良LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，當OD600nm值達到0.5～0.6時，離心，收集菌體，進行熱處理。菌株分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃水浴30 min，考察溫度對菌株存活率的影響；菌株分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃水浴0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，考察時間對菌株存活率的影響。將處理完的菌株，適當稀釋，然后涂布于改良LB培養(yǎng)基平板，進行菌落計數(shù)[18]，以未處理的菌株為對照，計算菌株存活率，其計算公式如下：

1.3.5 Hsp33基因表達的檢測

取OD600nm值為0.5～0.6的發(fā)酵液5 mL，10 000 r/min離心10 min，收集菌體，無菌水水洗兩次，用1 mL蒸餾水懸浮，然后取500 μL分別在40 ℃和50 ℃條件下熱處理20 min和30 min。采用mRNA提取試劑盒提取RNA，用微量RNA測量儀在波長260 nm處測定RNA含量。采用One-Step RT-PCR kit進行RT-PCR，具體方法參考文獻[19]。

2 結果與分析

2.1 Hsp33基因的克隆

以嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1的DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。

圖1 Hsp33基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of Hsp33 gene

由圖1可知，克隆出一條堿基長度在700～100 bp的目的條帶，將條帶回收后寄上海生工生物技術有限公司進行測序，測序結果見圖2。

圖2 Hsp33基因的核苷酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of Hsp33 gene

由圖2可知，Hsp33基因的堿基長度為876 bp，為一個完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該基因與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1vzy的Hsp33基因相似性達到99%，與阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）Hsp33的基因相似性達到99%。說明克隆的基因是Hsp33基因序列。將該基因序列提交至NCBI，通過BLAST比對，對Hsp33蛋白的保守序列進行分析，結果見圖3。

圖3 Hsp33蛋白保守序列分析Fig.3 Conserved sequence analysis of Hsp33 protein

由圖3可知，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33屬于HslO超基因家族，在羧基端具有4個半胱氨酸殘基構成的依賴氧化還原激活開關，此外具有7個氨基酸殘基構成的二聚體表面結合位點和7個氨基酸殘基構成的二聚體結構域結合位點。

2.2 Hsp33蛋白結構分析

通過Prot Param程序?qū)κ葻嶂就裂挎邨U菌的Hsp33蛋白進行一級結構分析，結果顯示，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白由292個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為31 706.20，蛋白質(zhì)理論等電點為4.93，編碼的蛋白質(zhì)分子式為C1395H2238N374O438S14，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為33.02，蛋白質(zhì)親水性平均值為-0.157。其酸性氨基酸和親水性氨基酸較多（經(jīng)比較，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白與Bacillussubtilis1vzy的Hsp33蛋白親水性基本相似，但親水性都低于Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655的Hsp33蛋白）。蛋白序列含有20種氨基酸，含量最多的是丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸。含量較少的為組氨酸、色氨酸，其中堿性氨基酸32個、酸性氨基酸40個（經(jīng)比較，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白與Bacillus subtilis1vzy的Hsp33蛋白電負性均低于Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655的Hsp33蛋白）。使用在線軟件DNA MAN對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1、Bacillus subtilis1vzy的Hsp33氨基酸序列進行比對，結果見圖4。

圖4 嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1與枯草桿菌1vzy的Hsp33氨基酸序列比對結果Fig.4 Alignment results of amino acid sequences of Hsp33 from Geobacillus stearothermophilus GL-1 and Bacillus subtilis 1vzy

由圖4可知，兩菌株的Hsp33氨基酸序列的一致性為73.3%，序列相似性為86.9%，同源性較高，親緣關系較近。

對嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白的疏水性、卷曲螺旋位置及蛋白的信號肽進行分析，結果見圖5。

圖5 嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1的Hsp33蛋白的疏水性（A）、卷曲螺旋（B）、信號肽（C）分析結果Fig.5 Analysis results of hydrophobicity (A),crimp helix (B) and signal peptide (C) of Hsp33 protein from Geobacillus stearothermophilus GL-1

由圖5可知，Hsp33蛋白的疏水性氨基酸數(shù)量為126，無卷曲螺旋、信號肽。利用SOPMA軟件分析嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白的二級結構，并且與Bacillus subtilis1vzy和Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655 Hsp33蛋白進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白的α-螺旋結構在二級結構中占比較大，為44.52%，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角僅占很少一部分。有文獻報道，較多的α-螺旋氨基酸殘基的存在有利于蛋白質(zhì)結構的穩(wěn)定，提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[20]。使用在線軟件Pymol構建嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1、枯草桿菌1vzy的Hsp33蛋白的三級結構，結果見圖6。

圖6 嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1（A）與枯草芽孢桿菌1vzy（B）的Hsp33蛋白的三級結構Fig.6 Tertiary structure of Hsp33 protein of Geobacillus stearothermophilus GL-1 (A) and Bacillus subtilis 1vzy (B)

由圖6可知，嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1、枯草芽孢桿菌1vzy的Hsp33蛋白除C末端結構域有所差距外，其他部分基本相同，說明兩者具有相似的核心結構域，這也更加證明了兩者之間的同源性。對于兩者結構的差異對蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響有待于研究。

2.3 熱脅迫對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1生長的影響

圖7 熱脅迫對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1存活率的影響Fig.7 Effect of heat stress on the survival rate of Geobacillus stearothermophilus GL-1

由圖7可知，嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1在不同溫度處理下存活率變化很大，在40 ℃、50 ℃處理30 min后，菌株存活率分別為95%、93%；在60 ℃處理30 min后，菌株存活率降至65%；處理溫度＞60 ℃之后，隨著溫度的升高存活率逐步下降，在90 ℃處理30 min后，菌株存活率0.5%。

由圖8可知，40 ℃條件下處理嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1存活率保持恒定，基本維持在90%以上；50 ℃條件下處理時間＞40 min之后，菌株的存活率陡然下降，70 min時接近1%；60 ℃條件下處理30 min，菌株的存活率下降到35%，70 min時存活率＜1%；70 ℃條件下處理10 min，菌株的存活率降至65%，30 min時存活率＜1%。結果表明，菌株可以耐受40 ℃高溫。

圖8 熱脅迫時間對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1存活率的影響Fig.8 Effect of heat stress time on the survival rate of Geobacillus stearothermophilus GL-1

2.4 熱脅迫條件下Hsp33基因的表達

圖9 RT-PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.9 Results of agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplification products

由圖9可知，與對照組相比，嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1經(jīng)熱處理后Hsp33基因表達量增加。在40 ℃條件下熱處理20 min，菌株Hsp33的基因表達量比處理30 min低。50 ℃條件下熱處理20 min和30 min，菌株Hsp33基因的表達量基本相同，但均高于40 ℃熱處理時菌株Hsp33基因的表達量。

3 結論

通過PCR擴增獲得嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）GL-1的Hsp33基因，該基因堿基長度為876 bp，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1vzy的Hsp33基因序列相似性達到99%，其表達的蛋白質(zhì)結構與Bacillus subtilis1vzy的Hsp33蛋白具有相似的核心結構域，二者除C-末端稍有不同外，具有相同的β-折疊和α-螺旋，無卷曲螺旋。熱脅迫對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1生長具有影響，當嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1菌株受到熱脅迫時，Hsp33基因表達量增加，說明在受到脅迫時，Hsp33蛋白作出了應激反應，可以抵御環(huán)境脅迫給細胞帶來的傷害。在嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1中，Hsp33基因表達與外界脅迫的關系還需要進一步的研究和探討。