賀秋紅，鞏志金 *，顏 梅，李桂芝

（1.曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273100；2.農(nóng)業(yè)部海藻類肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266000）

海藻寡糖（algal oligosaccharides，AOS）是由聚合度較低的β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）與α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）連接而成的低聚糖，是海藻多糖經(jīng)過酸、氧化劑或裂合酶降解而獲得的小分子質(zhì)量片段。海藻寡糖具有許多重要的生物學(xué)功能，如具有抗氧化活性[1-2]、抗凝血活性[3]、降血壓活性[4]、免疫調(diào)節(jié)活性[5]、植物生長調(diào)節(jié)活性[6-8]、誘導(dǎo)植物抗病活性[9]、促進(jìn)逆境中食用菌的生長[10]等作用。

海藻多糖鈉鹽即海藻酸鈉（sodium alginate，AGS），是生產(chǎn)海藻寡糖的主要原料，主要也是由β-D-甘露糖醛酸與α-L-古羅糖醛酸以3種方式（MM段、GG段和MG段）通過α-1,4糖苷鍵連接而成，是一種高聚合度的多糖類物質(zhì)。海藻酸鈉由于具有水溶性差、凝膠性強(qiáng)、黏度大等性質(zhì)，限制了其在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用，但其降解產(chǎn)物——海藻寡糖，聚合度低、分子質(zhì)量小，易溶于水，容易被吸收，且具有多種生理活性，使其逐漸成為研究熱點(diǎn)。

海藻寡糖的制備方法主要有酸降解法[11]、物理降解法[12]、氧化降解法[13]和酶解法[14]等，其中傳統(tǒng)的生產(chǎn)就是通過酸水解海藻酸鈉，但是高濃度酸溶液和復(fù)雜的分離純化步驟，不僅對(duì)環(huán)境造成污染，而且提取效率低，產(chǎn)物的聚合度難以控制[15]。而酶解法制備海藻寡糖不僅反應(yīng)條件溫和、節(jié)能環(huán)保，而且產(chǎn)物聚合度可控性強(qiáng)，產(chǎn)物容易分離純化，提取效率高，因此酶法制備海藻寡糖逐漸成為近年來研究的熱點(diǎn)[16]。黃菊等[17]使用商業(yè)的褐藻膠裂解酶酶解海藻酸鈉制備海藻膠低聚糖，產(chǎn)率高達(dá)75%。包華芳等[18]利用褐藻膠裂解酶酶解海藻酸鈉制備海藻寡糖并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。許雷等[19]用酶解法制備海藻寡糖并研究其吸濕及保濕性能。陳淑瓊等[20]優(yōu)化了酶解制備褐藻寡糖的工藝條件，并研究了褐藻寡糖的抗氧化活性和抑菌活性。本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解海藻酸鈉生產(chǎn)海藻寡糖工藝，得到制備海藻寡糖的最佳酶解條件，同時(shí)也為酶法制備海藻寡糖的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉（化學(xué)純）：青島聚大洋藻業(yè)集團(tuán)有限公司；海藻膠裂解酶（1×104U/mL）：青島百成海洋生物資源有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硫酸鈉、無水乙醇、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚（均為分析純）：國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3EpH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TZL-98型恒溫振蕩器：浙江省寧波市醫(yī)療器械廠；全自動(dòng)新型ZRD-A7080P鼓風(fēng)干燥箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以海藻寡糖平均聚合度（average degree of polymerization，DP）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察酶解時(shí)底物質(zhì)量濃度（0.6 g/100 mL、0.8 g/100 mL、1.0 g/100 mL、1.2 g/100 mL、1.4 g/100 mL、1.6 g/100 mL）、酶解溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）及酶解pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）對(duì)海藻酸鈉酶解效果的影響[2，19]。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶法提取海藻寡糖的工藝

利用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用單因素試驗(yàn)確定的中心值（用“0”表示）、低水平（用“-1”表示）和高水平（用“+1”表示），以海藻寡糖的平均聚合度（Y）為響應(yīng)值，對(duì)酶解反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度（A）、酶解溫度（B）及酶解pH值（C）進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳酶解條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.3 分析檢測

體系中總糖含量與還原糖含量的比值，即為體系的平均聚合度[21]，其中還原糖含量采用DNS法[22]測定，總糖含量用苯酚-硫酸法[14]測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶法提取海藻寡糖的影響

海藻酸鈉水解越徹底，酶解體系中還原性糖含量越高，海藻寡糖平均聚合度就越低。不同底物質(zhì)量濃度對(duì)海藻酸鈉酶解效果的影響見圖1。由圖1可知，隨著海藻酸鈉質(zhì)量濃度的增加，海藻寡糖的平均聚合度呈現(xiàn)先降后升的趨勢，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL時(shí)，海藻寡糖的平均聚合度最小，為4.08，即此時(shí)海藻酸鈉水解效果最佳，故將1.0g/100mL作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中海藻酸鈉質(zhì)量濃度的中心點(diǎn)。

圖1 底物質(zhì)量濃度對(duì)海藻酸鈉酶解效果的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on sodium alginate hydrolysis

2.1.2 酶解溫度對(duì)酶法提取海藻寡糖的影響

酶解溫度對(duì)海藻酸鈉酶解效果的影響見圖2。由圖2可知，隨著酶解溫度升高，海藻寡糖平均聚合度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，當(dāng)酶解溫度為40 ℃時(shí)，海藻寡糖平均聚合度達(dá)到最小，達(dá)到3.85，故將40 ℃作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中酶解溫度的中心點(diǎn)。

圖2 酶解溫度對(duì)海藻酸鈉酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on sodium alginate hydrolysis

2.1.3 酶解pH值對(duì)酶法提取海藻寡糖的影響

圖3 酶解pH值對(duì)海藻酸鈉酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH on sodium alginate hydrolysis

不同酶解pH值對(duì)海藻酸鈉酶解效果的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著酶解pH值的增加，海藻寡糖平均聚合度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，當(dāng)酶解pH值為8.0時(shí)，海藻寡糖平均聚合度為4.05，達(dá)到最低值；酶解pH值＞8.0時(shí)，海藻寡糖平均聚合度顯著上升，故將pH值為8.0作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中酶解pH值的中心點(diǎn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取海藻寡糖的工藝

2.2.1 回歸方程建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以底物質(zhì)量濃度（A）、酶解溫度（B）及酶解pH值（C）為自變量，海藻寡糖平均聚合度（Y）為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

采用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到海藻寡糖平均聚合度（Y）對(duì)底物質(zhì)量濃度（A）、酶解溫度（B）及pH值（C）的多元二次回歸方程：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression mode for response surface experiments

由表3可知，該模型顯著（P=0.004 2＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.177 8＞0.05），決定系數(shù)R2=0.920 7，說明有92.07%的變差能夠由該模型解釋；變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為2.6%，說明變異（偏離）程度較小。因此，該模型具有良好的擬合度，能真實(shí)地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可對(duì)海藻膠裂解酶水解海藻酸鈉生產(chǎn)海藻寡糖的酶解條件進(jìn)行預(yù)測和分析。

2.2.2 各因素響應(yīng)面交互作用分析

采用Design Expert8.0.5軟件對(duì)影響海藻膠裂解酶水解海藻酸鈉生產(chǎn)海藻寡糖的3個(gè)因素進(jìn)行交互分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)A=0.98，B=39.82，C=7.99，對(duì)應(yīng)的實(shí)際取值為A=1.0，B=40，C=8.0。根據(jù)實(shí)際操作條件優(yōu)化，得最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度1.0 g/100 mL，酶解溫度40 ℃，酶解pH值8.0，預(yù)測海藻寡糖平均聚合度為3.84，實(shí)際值為4.08。實(shí)際值與預(yù)測值基本接近，說明所建模型擬合良好且可靠。

圖4 底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和酶解pH值交互作用對(duì)海藻寡糖平均聚合度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between substrate concentration,enzymatic hydrolysis temperature and pH on average degree of polymerisation of algal oligosaccharides

2.3 最優(yōu)酶解條件的確定及驗(yàn)證

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃院陀行?，分別用模型預(yù)測的最優(yōu)酶解條件和原始酶解條件進(jìn)行海藻寡糖酶解試驗(yàn)，檢測不同取樣時(shí)間海藻寡糖平均聚合度，結(jié)果見圖5。

圖5 酶解條件優(yōu)化前后海藻寡糖平均聚合度的變化Fig.5 Changes of average degree of polymerisation of algal oligosaccharide before and after optimization of enzymatic hydrolysis conditions

由圖5可知，在酶解1.5 h后，優(yōu)化后海藻寡糖平均聚合度為4.08，比優(yōu)化前的海藻寡糖平均聚合度5.62降低了27.35%。模型的預(yù)測值與實(shí)際酶解結(jié)果接近，說明模型能較好的反映底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和酶解pH值對(duì)海藻膠裂解酶水解海藻酸鈉制備海藻寡糖的影響，預(yù)測性良好。聚合度（degree of polymerization，DP）優(yōu)于大部分已報(bào)道的酶解產(chǎn)海藻寡糖的結(jié)果[2，19-20]，達(dá)到優(yōu)化目的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行酶解條件的優(yōu)化，得到最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度1.0 g/100 mL、酶解溫度為40 ℃和酶解pH值8.0。在最佳酶解條件下，海藻寡糖的平均聚合度為4.08。本試驗(yàn)也獲得了一個(gè)能較好反映底物濃度、酶解溫度和酶解pH對(duì)海藻膠裂解酶水解海藻膠制備海藻寡糖的模型，為酶解提取海藻寡糖的條件優(yōu)化提供了技術(shù)參考。