賈西貝，王琦琦，李 楊，褚貴新，孫燕飛*

（1.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.紹興文理學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程系，浙江 紹興 312000）

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的大力發(fā)展，在農(nóng)田中濫用農(nóng)藥、化肥等行為頻繁出現(xiàn)，導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降、食品安全性存在隱患。與此同時，人們開始廣泛關(guān)注具有以環(huán)保、安全、作用持久等諸多優(yōu)點的植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）。因此，大量的促生菌被運用到科研中，并進一步深入到對促生菌生理效應(yīng)、作用機制的研究以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。

吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA）是普遍存在于植物體內(nèi)的生長調(diào)節(jié)劑，其對植物生長有顯著的影響[1]。有相關(guān)實驗表明，IAA在植物體內(nèi)參與許多生理生化的調(diào)節(jié)和控制，如細胞的伸長生長、形成層細胞的分裂、維管組織的分化等[2]。此外，IAA能通過對土壤內(nèi)重金屬的吸收和富集，使重金屬對植物的毒害減小，從而起到保護植物的作用[3-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種PGPR菌株可以產(chǎn)生IAA，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）等[6-8]。它們可以通過固氮、溶磷、分泌植物激素等方式，使植物的抗逆性提高，從而促進植物快速生長以及農(nóng)作物產(chǎn)量增加[9-10]。目前，對具有分泌IAA能力的PGPR的研究已成為熱門領(lǐng)域，可以通過對菌株發(fā)酵條件優(yōu)化或者增施PGPR菌肥來提高目標代謝產(chǎn)物[11-12]。張振等[13]從植物根際土壤中篩選出的耐鹽節(jié)桿菌能分泌IAA，經(jīng)過一系列單因素試驗，得到了最佳發(fā)酵條件，在最優(yōu)的條件下，該菌株產(chǎn)IAA能力可達92.31 mg/L。徐偉慧等[14]研究了不同西瓜PGPR分泌IAA的能力，其中一株菌的IAA產(chǎn)量高達117.3 mg/L。也有研究表明，PGPR的促生效果會受到土壤類型的影響，李哲[15]將標記菌株接種在未滅菌的土壤中，發(fā)現(xiàn)其存活能力較好，推測原因可能是土壤中其他生物的分泌物質(zhì)對其生長產(chǎn)生了有利的作用。但還有一些文獻報道，很多根際促生菌在滅菌土壤中的存活能力要大于未滅菌土壤，由此可見，選擇適合本地環(huán)境的PGPR十分重要[16-17]。

本實驗室從堿蓬（Suaeda salsa）根際土壤中分離出一株產(chǎn)IAA菌株，利用單因素及響應(yīng)面分析法對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，旨在提高IAA產(chǎn)量，為后續(xù)生物促生菌肥的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤樣品及處理

選取新疆維吾爾自治區(qū)石河子市周邊土壤鹽漬化較為嚴重的區(qū)域，采集該區(qū)域（兵團八師147團）內(nèi)生長情況良好的堿蓬根際土壤，將其立即過2 mm的篩網(wǎng)，封裝土樣于無菌自封袋中，液氮冷凍保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

Salkowski顯色劑：0.5 mol/L FeCl3與35%HClO4體積比按1∶50配制；吲哚乙酸（IAA）（分析純）：美國Sigma公司；L-色氨酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（斜面培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0 g/L，NaCl 50.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.4。121 ℃滅菌20 min。

1/2MS培養(yǎng)基：大量元素50 mL，鈣鹽50 mL，微量元素10 mL，鐵鹽10 mL，有機溶液10 mL，瓊脂8 g，蔗糖30 g，pH值6.8，定容至1 L。121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基、基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基采用LB液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

X3R高速冷凍離心機FroFleX聚合酶鏈式反應(yīng)（poly merase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RS-232精密電子天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；759S紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；ZWY-211B搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

在裝液量為100 mL/250 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入5 g堿蓬根際土樣，28 ℃、180 r/min搖床富集培養(yǎng)1 d。對此菌液進行10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋，取其稀釋液各100 μL，采用稀釋涂布平板法涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，獲得單菌落，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基后培養(yǎng)48 h，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 產(chǎn)IAA菌株的篩選及含量測定[18-19]

定性初篩：將分離純化后的菌株接種于質(zhì)量濃度為100 mg/LL-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入等量Salkowski顯色液進行顯色反應(yīng)。以加入50 μL IAA（50 mg/L）的標準液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫、避光條件下放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)IAA。

吲哚乙酸標準曲線的制作：配制質(zhì)量濃度分別為0、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL的IAA標準溶液，并按照1∶1體積比與Salkowski顯色劑混合，室溫避光30 min，分別在波長530 nm條件下測定其吸光度值，以蒸餾水按照1∶1體積比與Salkowski顯色劑混合液為空白對照，以IAA標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，OD530nm值（y）為縱坐標繪制IAA標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=0.01x-0.073 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 1。

IAA含量測定：篩選菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后取出，4 000 r/min離心15 min，取上清液4 mL與等體積Salkowski顯色劑混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，測定OD530nm值。根據(jù)IAA標準曲線回歸方程計算菌液中IAA含量。

1.3.3 菌株的鑒定

挑取IAA產(chǎn)量最高的菌株單菌落于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至對數(shù)期后，使用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取基因組總DNA[15]。用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTACGACTT-3'）對菌株16S rRNA基因進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板1 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，5 μmol/L引物27F 1 μL，5 μmol/L 1492R 1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、1 min，共30個循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將16S rRNA基因序列上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得登錄號，并將其序列于NCBI中進行比對，使用MEGA 6.0，用鄰接法（neighbour joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.3.4 擬南芥平板試驗

為了探究短小芽孢桿菌BG-5的促生效果，在1/2MS平板培養(yǎng)基中央用滅菌打孔器打直徑為1 cm的孔，將2 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基注入孔內(nèi)，移取表面消毒后的種子，種于距中心約2.5 cm的位置，每個平板種8粒，16 h黑暗，8 h光照，18 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，待擬南芥發(fā)芽長出些許嫩葉后，挑取篩選得到的BG-5菌株，接種于中央的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，以接種無菌水為對照組（CK）。擬南芥生長30 d后，觀察其生長情況。

1.3.5 菌株種子液的制備、發(fā)酵培養(yǎng)及生長曲線的測定

種子液的制備：于活化斜面挑取一環(huán)篩選得到的高產(chǎn)IAA的菌株BG-5接種至裝液量為30 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)9 h，得種子液；發(fā)酵培養(yǎng)：在無菌環(huán)境中，取種子液1 mL至裝液量為30 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

生長曲線的測定：取活化斜面后的菌株BG-5一環(huán)接種至裝液量為30 mL/250 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。每2 h取一次樣，測定發(fā)酵液在波長600 nm條件下的OD600nm值，并繪制菌株的生長曲線。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

（1）單因素試驗

碳源及其添加量的確定[20]：以5 g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、玉米粉、山梨醇、酵母提取物為碳源，碳源添加量梯度分別為3 g/L、5 g/L、7 g/L、10 g/L、15 g/L，考察不同碳源及碳源添加量對IAA含量的影響。

氮源及其添加量的確定：以10g/L的尿素、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、胰蛋白胨為氮源，氮源添加量梯度分別為5g/L、7 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，考察不同氮源及氮源添加量對IAA含量的影響。

金屬離子及其添加量的確定：以10 g/L的NaCl、CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、MnSO4為金屬離子，篩選金屬離子含量梯度分別為5 g/L、7 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，考察不同金屬離子及添加量對IAA含量的影響。

（2）響應(yīng)面分析試驗

采用單因素試驗選取培養(yǎng)基成分的濃度范圍，并根據(jù)響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗方案進行設(shè)計，以酵母提取物添加量（A）、胰蛋白胨添加量（B）和MgSO4·7H2O添加量（C）為自變量，以IAA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方，并進行驗證。

1.3.7 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

在裝液量分別為10 mL/250 mL、30 mL/250 mL、50 mL/250 mL、70 mL/250 mL、100 mL/250 mL，初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0及發(fā)酵溫度分別為24 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃條件下，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分別考察裝液量、初始pH值及發(fā)酵溫度對IAA含量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和篩選

一共篩出5株菌株進行定性初篩，并對產(chǎn)生IAA的菌株進行定量檢測，結(jié)果見表1。由表1可知，有2株產(chǎn)生IAA，結(jié)合IAA的產(chǎn)量測定，選取一株產(chǎn)IAA能力較好的菌株進行后續(xù)實驗，并根據(jù)采集地及采集部位將其編號為BG-5。

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of strains

2.2 菌株的鑒定

根據(jù)16S rDNA測序與NCBI數(shù)據(jù)庫基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對的結(jié)果，對產(chǎn)IAA菌株BG-5與參比菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果如圖1所示，菌株BG-5與Bacillus zhangzhouensisstrain D10302（GenBank核酸登錄號為MK070088.1）的同源性高達93%，故將菌株BG-5鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），將核酸序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，其登錄號為MK016484。

圖1 菌株BG-5基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain BG-5 based on 16S rRNA gene sequences

2.3 擬南芥平板試驗

結(jié)果如圖2所示，與不接菌株的對照（左邊平皿）相比，擬南芥的葉表面積有所增加，表明短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）BG-5可以產(chǎn)生某種物質(zhì)能夠促進擬南芥生長。

圖2 菌株BG-5對擬南芥生長的促生效果Fig.2 Growth-promoting effect of strain BG-5 on Arabidopsis thalina

2.4 菌株BG-5的生長曲線

圖3 短小芽孢桿菌BG-5的生長曲線Fig.3 Growth curve of Bacillus pumilus BG-5

對菌株BG-5進行生長曲線的繪制，結(jié)果見圖3。由圖3可知，2～6 h為菌株BG-5的延遲期，從第8小時開始該菌株進入對數(shù)生長期，其后菌體生長迅速，菌體濃度快速升高；12～18 h菌體生長速度逐漸減小至平緩。因此，選擇培養(yǎng)8～10 h的菌體作為種子液。

2.5 培養(yǎng)基組分及含量對短小芽孢桿菌BG-5產(chǎn)吲哚乙酸的影響

通過對不同培養(yǎng)基組分及含量的篩選，結(jié)果見圖4。由圖4a1可知，在培養(yǎng)基中不加碳源，短小芽孢桿菌BG-5的吲哚乙酸產(chǎn)量最少，但該菌株對于酵母提取物、玉米粉和蔗糖的利用較有效，其中酵母提取物作為碳源時產(chǎn)吲哚乙酸量最高，達到44.17 μg/mL。因此，選擇酵母提取物作為最佳碳源。由圖4a2可知，隨著酵母提取物添加量的增加，IAA的產(chǎn)量先增加后減小，當其酵母提取物添加量為7 g/L時，IAA產(chǎn)量達到最大，為85.37 μg/mL。因此，選擇最適酵母提取物添加量為7 g/L。

圖4 不同培養(yǎng)基組分及添加量對菌株BG-5產(chǎn)吲哚乙酸的影響Fig.4 Effect of different medium component and addition on indoleacetic acid yield by strain BG-5

由圖4b1可知，胰蛋白胨為氮源所產(chǎn)的IAA量最高，其IAA產(chǎn)量達到最高，為51.97 μg/mL。因此，選擇胰蛋白胨作為最佳碳源。由圖4b2可知，隨著胰蛋白胨添加量的增加，IAA的產(chǎn)量也隨之增加，當胰蛋白胨添加量為10 g/L時，IAA產(chǎn)量最大，達81.02 μg/mL，進一步增加胰蛋白胨添加量，IAA產(chǎn)量減小，原因為高濃度的胰蛋白胨導(dǎo)致碳氮比降低，不利于產(chǎn)物積累。因此，選擇胰蛋白胨最適添加量為10 g/L。

由圖4c1可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10 g/L Mg2+、Na+、Ca2+時，IAA產(chǎn)量較高；其中當加入Mg2+時產(chǎn)IAA最高，高達64.37 μg/mL。因此，選擇Mg2+作為最佳金屬離子。由圖4c2可知，隨著七水硫酸鎂添加量的增加，IAA產(chǎn)量先增加后減少，當其添加量為7 g/L時，IAA產(chǎn)量達到最大，為65.17μg/mL。因此，選擇最適七水硫酸鎂的添加量為7 g/L。

2.6 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

以單因素試驗為基礎(chǔ)，對菌株BG-5產(chǎn)IAA發(fā)酵培養(yǎng)基進行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3，各因素間的交互作用對短小芽孢桿菌BG-5產(chǎn)吲哚乙酸的影響結(jié)果見圖5。

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments

續(xù)表

利用Design-Expert 10.0軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到吲哚乙酸產(chǎn)量（Y）對酵母提取物添加量（A）、胰蛋白胨添加量（B）和MgSO4·7H2O添加量（C）的二次多項回歸方程為：Y=86.57-5.31A-18.13B-0.14C-4.33AB+7.06BC-17.90A2-16.86B2-14.5C2。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模型的P值為0.008 4＜0.01，表明模型對試驗結(jié)果具有極顯著的影響；而失擬項P值=0.090 7＞0.05，不顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果的影響較?。辉撃Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.901 6，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值較低為16.44%，由此可知回歸方程的擬合度較好，可信度高，可以用此模型對短小芽孢桿菌BG-5產(chǎn)IAA量進行預(yù)測?；貧w方程的一次項B和二次項A2對IAA產(chǎn)量有極顯著影響（P＜0.01），二次項B2、C2對IAA產(chǎn)量有顯著的影響（P＜0.05），其他因素對IAA產(chǎn)量的影響不顯著（P＞0.05）。通過響應(yīng)面優(yōu)化得出短小芽孢桿菌BG-5產(chǎn)吲哚乙酸的最佳培養(yǎng)基配方為酵母提取物7.298 g/L、胰蛋白胨8.773 g/L、七水硫酸鎂7.151 g/L，IAA產(chǎn)量預(yù)測值為91.838 μg/mL。為方便實際操作，將培養(yǎng)基組分修改為酵母提取物7.3 g/L、胰蛋白胨8.8 g/L、七水硫酸鎂7.2 g/L，在此最優(yōu)培養(yǎng)基組分下，得出實際IAA產(chǎn)量平均值為87.86 μg/mL，與預(yù)測值接近，說明模型具有很高的可靠性。

圖5 各因素間的交互作用對短小芽孢桿菌BG-5產(chǎn)吲哚乙酸影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on indoleacetic acid production by Bacillus pumilus BG-5

2.7 不同培養(yǎng)條件對短小芽孢桿菌BG-5產(chǎn)吲哚乙酸的影響

由圖6a可知，當裝液量為30 mL/250 mL時，BG-5菌株產(chǎn)生的IAA量最多，達43.64 μg/mL。進一步增加裝液量，IAA的產(chǎn)量逐漸減少，這可能與發(fā)酵液中的溶氧量多少有關(guān)。因此，選擇最佳裝液量為30 mL/250 mL。

由圖6b可知，BG-5菌株在初始pH值為8時生長最好，產(chǎn)IAA量最高，為44.02 μg/mL，可能是因為pH值會影響菌株對培養(yǎng)基里各種營養(yǎng)物質(zhì)的有效吸收和利用，進而影響其細胞中的代謝酶活性，從而決定菌株的正常生長。因此，選擇最佳初始pH值為8。

由圖6c可知，發(fā)酵溫度為37 ℃時菌株產(chǎn)IAA量多，高達52.64 μg/mL，其次是42 ℃，菌株產(chǎn)IAA量為49.74 μg/mL。溫度過高或過低都會降低產(chǎn)IAA相關(guān)酶的活性。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖6 不同培養(yǎng)條件對菌株BG-5產(chǎn)吲哚乙酸的影響Fig.6 Effects of different fermentation conditions on indoleacetic acid production by strain BG-5

3 結(jié)論

本實驗室對從新疆鹽堿地的堿蓬根際中分離獲得一株產(chǎn)IAA的PGPR進行了一系列優(yōu)化試驗，確定其最佳培養(yǎng)條件為裝液量30 mL/250 mL、起始pH值為8、培養(yǎng)溫度37 ℃，菌株BG-5產(chǎn)吲哚乙酸的最佳培養(yǎng)基配方為酵母提取物7.3 g/L、胰蛋白胨8.8 g/L、七水硫酸鎂7.2 g/L。在最優(yōu)條件下，IAA產(chǎn)量為87.86 μg/mL，約為優(yōu)化前（39.70 μg/mL）的2倍。該試驗為功能微生物肥料的研發(fā)提供了更多選擇，也為后續(xù)菌株的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。