何家偉，杜 馨，蔡 俊*

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）是蛋白質(zhì)中硒的主要存在形式，也是唯一含有準(zhǔn)金屬元素的氨基酸[1]。Sec被稱為第21種氨基酸[2]，作為活性中心存在于谷胱甘肽過氧化酶、硫氧還蛋白還原酶、甘氨酸還原酶、甲酸脫氫酶等含硒酶中。其在合成高活性硒化物，生產(chǎn)富硒食品，醫(yī)藥保健方面有著巨大潛力。如硒代半胱氨酸的甲基化衍生物硒甲基半胱氨酸（methyl selenocysteine，SeMcys）是一種有著良好抗癌前景的物質(zhì)。硒甲基半胱氨酸具有補(bǔ)硒、防治癌癥、抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病、解重金屬毒等作用[3]。硒代半胱氨酸是多種低分子硒代多肽類物質(zhì)的組分[4]。包含硒代半胱氨酸殘基的蛋白稱為硒蛋白[5]。含有硒代半胱氨酸的硒蛋白有多種重要作用[6]，是人和動(dòng)物體內(nèi)是不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，大規(guī)模生產(chǎn)硒代半胱氨酸有著良好的市場(chǎng)效益。目前可利用化學(xué)法和生物法合成硒代半胱氨酸。

1 化學(xué)法合成硒代半胱氨酸

化學(xué)法合成硒代半胱氨酸先用氯丙氨酸（C3H6ClNO2）與二硒化鈉（Na2Se2）反應(yīng)生成硒代胱氨酸（SeC），然后用金屬鈉/液氨在-70 ℃的條件下將硒代胱氨酸還原裂解成硒代半胱氨酸[7]。該方法中的化學(xué)反應(yīng)需在-70 ℃的條件下進(jìn)行，且需用到性質(zhì)活潑的金屬鈉，反應(yīng)條件苛刻，工藝設(shè)備要求高，氯丙氨酸原料價(jià)格高，生產(chǎn)成本高，很難投入大規(guī)模的生產(chǎn)中。

2 生物法合成硒代半胱氨酸

植物、動(dòng)物、微生物均能合成硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸在生物體內(nèi)合成需要依賴復(fù)雜的轉(zhuǎn)移核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）合成機(jī)制[8]，其tRNA起初由絲氨酸-tRNA連接酶加載絲氨酸（serine，Ser），但其無法被普通的翻譯因子識(shí)別。該絲氨?？杀缓辛姿徇炼呷┑奈腚装彼岷铣擅柑鎿Q為硒半胱胺酰。然后Sec-tRNA與硒特異延伸因子（SelB或mSelB）結(jié)合，通過核糖體翻譯該mRNA。無機(jī)硒通過硫的合成途徑，傳遞到核糖體，并插入到新生的硒蛋白[9]。生物法合成硒代半胱氨酸相較于化學(xué)法，反應(yīng)相對(duì)溫和，材料成本低廉，大規(guī)模生產(chǎn)方面更具前景。

2.1 植物合成硒代半胱氨酸及檢測(cè)提取方法

植物硒的主要來源是土壤中的硒。六價(jià)硒被吸收進(jìn)入植物葉綠體細(xì)胞后在谷胱甘肽和5-磷硫酸腺苷（adenosine 5-phosphosulfate，APS）的作用下轉(zhuǎn)化為四價(jià)硒，然后在植物葉綠體內(nèi)經(jīng)過半胱氨酸合成酶（cysteine synthase，CSase）的作用轉(zhuǎn)化成硒代半胱氨酸[10]。植物中硒代半胱氨酸合成效率較低，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)較為困難。不同植物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法見表1。

表1 不同植物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法Table 1 Extraction and detection methods of selenocysteine from different plants

2.2 動(dòng)物合成硒代半胱氨酸及檢測(cè)提取方法

動(dòng)物合成硒代半胱氨酸的途徑與微生物合成硒代半胱氨酸途徑相同，但動(dòng)物體內(nèi)硒的轉(zhuǎn)化效率和硒代半胱氨酸合成效率較低，提取手段較為復(fù)雜。在哺乳動(dòng)物中，比較基因組學(xué)和實(shí)驗(yàn)分析表明哺乳動(dòng)物的硒代半胱氨酸合成酶（selenocysteine synthetase，Secs）是含吡咯磷酸鹽（pyrrole phosphate）的蛋白質(zhì)[16]，被稱為可溶性肝抗原。硒代半胱氨酸合成酶需要磷酸硒和膦酰-tRNA[Ser]Sec作為底物產(chǎn)硒代半胱氨酸-tRNA[Ser]Sec[17]。此外，在由硒化物、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和絲氨酸組成的tRNA支架上，用tRNA[ser]sec、seryl-tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase）、膦酰-tRNA[Ser]SEC激酶（phosphonoy-tRNA[Ser]Seckinase）、激酶磷酸硒合成酶、硒代半胱氨酸合成酶在tRNA支架上合成了硒代半胱氨酸[18]。不同動(dòng)物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法見表2。

表2 不同動(dòng)物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測(cè)方法Table 2 Extraction and detection methods of selenocysteine from different animals

2.3 微生物合成硒代半胱氨酸

圖1 釀酒酵母硫硒氨基酸生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of sulfur amino acid in Saccharomyces cerevisiae

硒酸鹽在還原酶的作用下與氨基酸結(jié)合成硒代氨基酸再參與生物體代謝，主要生成硒蛋白和含硒酶類。硒與硫在微生物中的代謝途徑和是相似的，均使用同一個(gè)絲氨酸代謝途徑[25]。圖1顯示了硒進(jìn)入微生物體內(nèi)后的代謝和硒代蛋氨酸（selenomethionine，SeMet）轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸途徑，以及硒代半胱氨酸合成硒代甲基半胱氨酸和谷胱甘肽途徑。硒化氫（H2Se）與O-乙酰絲氨酸（O-acetyl serine，OAS）在同型半胱氨酸合成酶作用下合成同型硒半胱氨酸，在蛋氨酸合成酶作用下合成硒代蛋氨酸。同型硒半胱氨酸與絲氨酸在半胱氨酸-β-合成酶作用下生成硒代胱硫醚，然后在胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase）的作用下生成硒代半胱氨酸（SeCys）。

硒代半胱氨酸的合成與selA、selB、selC、selD四個(gè)基因的產(chǎn)物相關(guān)[26]。SelC是一個(gè)特異性的硒代半胱氨酸-tRNASec，在進(jìn)行翻譯時(shí)，SelC會(huì)被氨?；?，在Seryl-tRNA合成酶催化完成反應(yīng)，同動(dòng)物硒代半胱氨酸合成途徑相似，形成SertRNASec提供了基本的碳骨架來生成硒代半胱氨酸[27]。

2.4 常用硒代半胱氨酸檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

比色法、熒光分光光度法、氫化物-原子熒光法、火焰原子吸收法、氫化物-原子吸收法、石墨爐-原子吸收法、催化動(dòng)力學(xué)光度法、高效液相色譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法[28]是常用測(cè)定總硒含量的方法。但上述方法并不能完全有效的檢測(cè)硒代半胱氨酸，需對(duì)硒代半胱氨酸進(jìn)行高效的分離提取，并與檢測(cè)方法聯(lián)用對(duì)硒代半胱氨酸進(jìn)行測(cè)定。硒代半胱氨酸檢測(cè)提取方法及優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

表3 硒代半胱氨酸檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)Table 3 Advantages and disadvantages of detection methods for selennocysteine

3 微生物發(fā)酵生產(chǎn)硒代半胱氨酸進(jìn)展

動(dòng)、植物生產(chǎn)硒代半胱氨酸成本高，且受季節(jié)、地域、氣候的限制。而微生物生長(zhǎng)速度快，原料經(jīng)濟(jì)廉價(jià)，便于培養(yǎng)，產(chǎn)出效率高，可通過控制培養(yǎng)條件提高產(chǎn)量，故利用微生物生產(chǎn)硒代半胱氨酸。

3.1 富硒菌種選育

硒代半胱氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)需先選育出高耐硒性菌株。硒酸鹽或亞硒酸鹽作為添硒劑，均對(duì)菌種產(chǎn)生毒性并對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用[29]，要想得到具有高硒積累能力的菌株，其在生長(zhǎng)過程中需表現(xiàn)出較高的抗硒鹽能力[30]，故選育菌種需有一定的耐硒性。篩選過程前需對(duì)菌種的富硒能力進(jìn)行評(píng)估，選用富硒能力強(qiáng)的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。菌種選育階段首先需考慮抗性篩選過程，對(duì)樣本菌種進(jìn)行不同濃度硒的梯度培養(yǎng)，以達(dá)到初篩目的。微生物主要利用透性酶對(duì)硒吸收，已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌硫透性酶基因有cysA，cysU，cysW，以上基因發(fā)生突變將會(huì)提高硒的耐受性[31]。在此基礎(chǔ)上對(duì)具有耐硒能力的菌種繼續(xù)采用誘變育種的方式篩選。

富硒誘變育種通常采用紫外線照射或亞硝酸等誘變劑進(jìn)行單因素誘變，王小波等[32]以富硒酵母Y2為出發(fā)菌株，通過60Coγ射線照射誘變育種，篩選獲得一株生物量和富硒能力都較高的突變菌株YR166，進(jìn)行富硒培養(yǎng)后硒含量達(dá)到2 531.4 μg/g，較原菌株提高74.2%，酵母生物量達(dá)到14.9 g/L，較原菌株提高36.7%。復(fù)合誘變相對(duì)于單因素誘變過程更為復(fù)雜，但可以更有針對(duì)性的培育菌種，達(dá)到更好的誘變效果。曾禮華等[33]以熱帶假絲酵母菌（Candida tropicalis）1254為出發(fā)菌株進(jìn)行了亞硝基胍誘變和亞硒酸鈉抗性篩選，紫外線誘變和乙硫氨酸抗性篩選等兩輪突變和篩選，獲得突變菌株1254-6-1，其生物量、總硒含量、有機(jī)硒的含量及轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%，分別為原始出發(fā)菌株的1.85倍、7.90倍、9.35倍、1.18倍。富硒復(fù)合誘變流程如下：硒鹽抗性初篩→選出硒耐受性及富硒能力強(qiáng)的菌株→亞硝基胍誘變及硒鹽抗性復(fù)篩→進(jìn)一步篩選富硒能力強(qiáng)的菌株→紫外誘變及乙硫氨酸抗性篩選→富硒菌株。以上步驟篩選出的菌株一般具有良好的抗硒性。從中繼續(xù)篩選硒代半胱氨酸產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。

3.2 硒代半胱氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化

通常有兩種硒源在實(shí)驗(yàn)中被廣泛使用，亞硒酸鈉（Na2SeO3）和硒酸鈉（Na2SeO4），對(duì)于兩種不同價(jià)態(tài)的硒，硒代半胱氨酸產(chǎn)率也不同。兩種硒鹽對(duì)菌體的生長(zhǎng)均有抑制作用，發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加硒酸鈉能提高有機(jī)硒的產(chǎn)量。因?yàn)閬單徕c不同于硒酸鈉，可與還原糖（如葡萄糖）反應(yīng)生成單質(zhì)Se[34]，而生物幾乎無法利用單質(zhì)Se。

發(fā)酵過程中，由于硒與硫在菌體吸收過程中的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，富硒過程中需控制硫與硒的比值發(fā)酵。MAPELLI V等[34]在高硫硒比和低硫硒比的情況下對(duì)釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)只有在缺硫的情況下硒才會(huì)被完全消耗，但由于硒鹽對(duì)菌體的毒性，在缺硫條件下細(xì)胞會(huì)生長(zhǎng)不良；在高硫硒比時(shí)，硒難以被菌體所吸收。合適的硫硒比在硒代半胱氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中尤為關(guān)鍵。酵母細(xì)胞在添加硒鹽后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞尺寸減小[35]，具體原因還有待研究。DHANJAL S等[36]發(fā)現(xiàn)隨著硒鹽濃度的增加，細(xì)菌細(xì)胞大小隨之減小。細(xì)胞大小和數(shù)量的減少在細(xì)胞形態(tài)上可歸因于高濃度有毒離子對(duì)生長(zhǎng)細(xì)胞施加的脅迫。換而言之，單個(gè)細(xì)胞體積減小，它們的相對(duì)表面積更大，能更好地吸收環(huán)境脅迫條件下的營養(yǎng)物質(zhì)。

發(fā)酵方式的選用對(duì)細(xì)胞營養(yǎng)吸收至關(guān)重要。補(bǔ)料分批發(fā)酵比其他發(fā)酵方式在調(diào)整營養(yǎng)物質(zhì)濃度方面有更大的優(yōu)勢(shì)。將常用碳源葡萄糖的濃度維持在適當(dāng)?shù)乃?，?yīng)用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，以控制葡萄糖效應(yīng)，提高細(xì)胞密度[37]。發(fā)酵過程中對(duì)發(fā)酵參數(shù)如酵母細(xì)胞產(chǎn)率、發(fā)酵效率、有機(jī)硒生產(chǎn)率、產(chǎn)量和消耗率、生物量、底物和硒代半胱氨酸的濃度等進(jìn)行測(cè)定。其他因素包括蒸發(fā)氣體損失，pH值測(cè)定，消泡手段，生物量體積，樣品的提取，這些都是影響酵母生長(zhǎng)的因素[38]。

4 展望

本文探討了硒代半胱氨酸的生物合成以及檢測(cè)提取方法。植物、動(dòng)物、微生物中均能合成硒代半胱氨酸，但植物、動(dòng)物中產(chǎn)硒代半胱氨酸效率較低，微生物較二者更適合生產(chǎn)硒代半胱氨酸。介紹了硒代半胱氨酸多種檢測(cè)提取方法。從菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化兩方面概述微生物發(fā)酵生產(chǎn)硒代半胱氨酸方法。需注意以下幾點(diǎn)：高耐硒性菌株的選育和誘變篩選方式選用，硒源、發(fā)酵方法的選取以及適當(dāng)硫硒比對(duì)微生物產(chǎn)硒代半胱氨酸的影響。

微生物合成硒代半胱氨酸可以從以下幾個(gè)方面拓展：（1）Sec常與其二聚體（Seenocystine，Sec2）混淆，易導(dǎo)致硒代半胱氨酸無法被準(zhǔn)確的定性和定量，該問題是Sec檢測(cè)方面值得深入研究?jī)?nèi)容。（2）在誘變育種基礎(chǔ)上能夠通過原生質(zhì)體融合或基因工程的方法進(jìn)一步提高菌種的耐硒性或是提高菌種產(chǎn)硒代半胱氨酸能力。（3）微生物利用硒代半胱氨酸產(chǎn)出相應(yīng)高活性硒化物。硒代半胱氨酸可在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶的催化下，與谷氨酸可能發(fā)生反應(yīng)生成谷氨酰硒半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶催化下該產(chǎn)物進(jìn)一步與甘氨酸反應(yīng)可能生成硒代谷胱甘肽。硒代谷胱甘肽（GSeH）是谷胱甘肽（glutathione，GSH）的硒類似物，氧化型硒代谷胱甘肽（selenoglutathione）是一種具有類似谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）抗氧化能力的物質(zhì)[39]，其還原物硒代谷胱甘肽的抗氧化能力更強(qiáng)。

堅(jiān)信隨著社會(huì)發(fā)展和研究深入，人們將會(huì)科學(xué)認(rèn)識(shí)和了解硒代半胱氨酸以及其衍生物，基于微生物發(fā)酵生產(chǎn)相應(yīng)高活性抗癌硒化物將越來越受人們青睞，在食品、醫(yī)療等方面具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和和社會(huì)效益。