朱衛(wèi)星，成聰聰，甘國(guó)興，申 雪，袁月梅，姚美村*

(1. 清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511510； 2. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

金盞銀盤(pán)(Bidensbiternata(Lour.) Merr. et Sherff.)是菊科鬼針草屬植物，以全草入藥，始載于唐代《本草拾遺》，味苦、平，無(wú)毒[1-2]，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒之效，臨床用于治療風(fēng)熱感冒、毒蛇咬傷、腸癰、濕熱瀉痢，也可外用于痔瘡等[3]。研究發(fā)現(xiàn)鬼針草屬植物主要含黃酮類、聚炔苷、苯丙素類、氨基酸及揮發(fā)油等多種成分，具有抑菌、保護(hù)心血管、抗炎鎮(zhèn)痛、抗干眼、抗衰老等多種藥理活性，常用于感冒、闌尾炎、痢疾、胃痛、高胰島素血癥等疾病的防治[4-7]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，藥物治療疾病的研究已進(jìn)入到細(xì)胞層面和基因水平[8]。不同于化學(xué)藥單靶點(diǎn)、高選擇性的特征，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，這種復(fù)雜性常常使得中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)制不清楚[9]，很大程度上限制了對(duì)中藥的深入研究。但隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地分析藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示藥物多成分協(xié)同作用的機(jī)理已成為可能；而且這種研究方法與中醫(yī)藥整體觀和辨證論治等不謀而合，為中藥研究從系統(tǒng)生物學(xué)角度提供了新的思路與研究方法[10-11]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路和方法，以傳統(tǒng)藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，網(wǎng)絡(luò)功能模塊識(shí)別為技術(shù)手段，利用相關(guān)軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)和成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，分析和預(yù)測(cè)鬼針草屬植物金盞銀盤(pán)治療多種疾病的分子機(jī)制，為金盞銀盤(pán)研究的深入開(kāi)展和臨床應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 金盞銀盤(pán)活性成分選擇

經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和查閱文獻(xiàn)，本研究選擇金盞銀盤(pán)中16個(gè)活性成分作為研究對(duì)象，其中將新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸，異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C異構(gòu)體分別整合作為一個(gè)成分，最終確定12個(gè)活性成分進(jìn)行研究。結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2 活性成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將上述化合物導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找主要活性成分相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，其中Okanin-O-glucoside，Okanin，Tricin-7-O-β-D-glucoside，Tri-caffeoylquinic acid等4個(gè)成分利用PubChem BioActivity Analysis Service[12]獲得其潛在作用靶標(biāo)。將候選化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白根據(jù)Uniport進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)，同時(shí)獲得靶點(diǎn)相應(yīng)的基因名稱，共獲得58個(gè)靶點(diǎn)。

表1 金盞銀盤(pán)的活性成分

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過(guò)程注釋

應(yīng)用STRING v10.5 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)金盞銀盤(pán)中關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體Gene Ontology(GO)富集，分析靶點(diǎn)蛋白在體內(nèi)可能的生物學(xué)過(guò)程。選擇GO中生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成3個(gè)模塊對(duì)基因進(jìn)行注釋，并繪制GO富集分析中相關(guān)條目的條形圖，以便更直觀的解釋。

1.4 信號(hào)通路分析

應(yīng)用STRING v10.5數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)金盞銀盤(pán)中關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集，物種和背景均為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，研究靶點(diǎn)蛋白與可能疾病之間的關(guān)系，明確金盞銀盤(pán)可能的藥理機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選出的12個(gè)活性成分和靶點(diǎn)構(gòu)建“成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。其中包含70個(gè)節(jié)點(diǎn)(12個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)和58個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))，共189條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，每條邊代表成分與靶點(diǎn)的潛在聯(lián)系，而一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值代表網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連路線的條數(shù)，表2列出了化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)及度值，其中前列腺素G / H合成酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，P35354)，蛋白酪氨酸磷酸酶的mRNA(mRNA of Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor type 1，P18031)，胰蛋白酶1(Trypsin-1，P07477)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(DNA topoisomerase II，P11388)，凝血因子X(jué)a(Coagulation factor Xa，P00742)等靶點(diǎn)出現(xiàn)的頻率較高，表明活性成分在靶點(diǎn)上具有協(xié)同性，且貢獻(xiàn)多重藥理作用，可能是金盞銀盤(pán)發(fā)揮藥效作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

圖1 金盞銀盤(pán)中的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Compound-target networks in B. biternata

蛋白編號(hào) Protein number靶點(diǎn)蛋白 Target protein度值 Value基因靶點(diǎn) Gene targetP35354Prostaglandin G/H synthase 27PTGS2P18031mRNA of Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor type 16PTPN1P07477Trypsin-13PRSS1P11388DNA topoisomerase II3TOP2AP00742Coagulation factor Xa3F10P11473Vitamin D3 receptor isoform VDRA2VDRP01375Tumor necrosis factor2TNFQ9NPD5Solute carrier organic anion transporter family member 1B32SLCO1B3Q9Y6L6Solute carrier organic anion transporter family member 1B12SLCO1B1P23219Prostaglandin G/H synthase 12PTGS1

2.2 GO功能富集分析

GO富集分析作為一種基因功能分類的系統(tǒng)，金盞銀盤(pán)活性成分的GO生物學(xué)過(guò)程富集結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明58個(gè)靶點(diǎn)可以參與體內(nèi)638個(gè)生物學(xué)過(guò)程，其中分子功能、細(xì)胞組分及生物過(guò)程3個(gè)部分分別富集到33，26，579個(gè)條目。其分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、催化活性及受體結(jié)合等方面；細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞器、膜封閉腔、外泌體、細(xì)胞質(zhì)及囊泡等方面；生物過(guò)程主要涉及對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、單一生物代謝、代謝過(guò)程調(diào)節(jié)、內(nèi)源性刺激、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激反應(yīng)及對(duì)含氧化合物的反應(yīng)等方面。

圖2 GO條目在生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能上的分布(FDR<0.05)Fig. 2 GO terms for biological processes, cell composition and molecular functions(FDR<0.05)

2.3 KEGG信號(hào)通路分析

利用STRING平臺(tái)對(duì)58個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集，根據(jù)FDR(FDR<0.05)得到113條信號(hào)通路，運(yùn)用京都基因和基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋和分析，共包括6大類，其中與人類疾病相關(guān)通路共49條，與有機(jī)體系相關(guān)通路共37條，與環(huán)境信號(hào)處理系統(tǒng)共14條，與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)通路共4條，與代謝相關(guān)通路共8條，與遺傳信息處理相關(guān)通路共1條。表3根據(jù)FDR值列出最為顯著的22條通路分析結(jié)果，分析表明阿米巴原蟲(chóng)病(S1)在人類疾病(傳染病)相關(guān)通路中最為顯著、5-羥色胺能突觸(S4)在神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)通路中富集最為顯著且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中HIF-1信號(hào)通路(S9)r及TNF信號(hào)通路(S10)較為顯著，表明這些通路分別與傳染病、神經(jīng)系統(tǒng)及炎癥疾病等密切相關(guān)(見(jiàn)圖3)。

表3 潛在作用通路

續(xù)表3

編號(hào)Number通路名稱Pathway通路分類Classification基因數(shù)Gene numberFDRS17hsa05161:Hepatitis BHuman Diseases72.30E-06S18hsa04064:NF-kappa B signaling pathwaySignal transduction62.88E-06S19hsa05144:MalariaHuman Diseases52.91E-06S20hsa04620:Toll-like receptor signaling pathwayOrganismal Systems65.88E-06S21hsa05166:HTLV-I infectionHuman Diseases86.88E-06S22hsa05145:ToxoplasmosisHuman Diseases69.86E-06

圖3 信號(hào)通路富集分析Fig. 3 Frichment analysis of signal pathway

利用Cytoscape 軟件構(gòu)建金盞銀盤(pán)主要活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，12個(gè)成分，58個(gè)蛋白與113條信號(hào)通路之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)，金盞銀盤(pán)的活性成分可通過(guò)不同的靶點(diǎn)蛋白在不同代謝通路及疾病中發(fā)揮作用，這與中藥“多組分，多靶點(diǎn)”的作用機(jī)理相一致。

3 討論

為探究金盞銀盤(pán)的作用機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念對(duì)金盞銀盤(pán)中活性成分進(jìn)行了靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，挖掘金盞銀盤(pán)活性成分、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路3個(gè)節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的特征信息。結(jié)果表明，金盞銀盤(pán)中12個(gè)活性成分，可作用于不同的靶點(diǎn)，關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路有113條，這說(shuō)明中藥確有多成分-多靶點(diǎn)-多通路的作用特點(diǎn)。在成分靶點(diǎn)分析中，前列腺素G / H合成酶2(P35354)、蛋白酪氨酸磷酸酶的mRNA(P18031)、胰蛋白酶1(P07477)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(P11388)、凝血因子X(jué)a(P00742)等靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度較高，提示這些靶點(diǎn)可能是金盞銀盤(pán)活性成分發(fā)揮作用的主要靶標(biāo)。而在關(guān)聯(lián)信號(hào)通路分析中發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲(chóng)病(S1)、5-羥色胺能突觸(S4)、HIF-1信號(hào)通路(S9)、TNF信號(hào)通路(S10)等在人類疾病(傳染病)通路、神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)通路及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的富集最為顯著，這可能與金盞銀盤(pán)在治療炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病方面的作用相關(guān)。

圖4 金盞銀盤(pán)中的活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Compound—target protein—signaling pathway network in B. biternata

通過(guò)對(duì)金盞銀盤(pán)活性成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化和抗炎可能是金盞銀盤(pán)中主要的藥理作用。金盞銀盤(pán)中蘆丁、金絲桃苷、綠原酸等成分，可作用于磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基(PIK3CG)、白細(xì)胞介素-8(IL8)、腫瘤壞死因子(TNF)、淀粉樣β蛋白(APP)、前列腺素G / H合成酶2(PTGS2)等關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與調(diào)控Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，這可能是其參與抗氧化、抗炎的可能機(jī)制之一。林海英[13]通過(guò)采用急性炎癥模型和免疫炎癥模型來(lái)研究鬼針草總黃酮的抗炎作用機(jī)制，結(jié)果表明鬼針草總黃酮可降低模型大鼠中TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8的表達(dá)，其抗炎機(jī)制可能直接通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)。胡宗福等[14]研究顯示綠原酸具有清除氧自由基的作用，且清除能力與濃度相關(guān)。都波等[15]也通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明金盞銀盤(pán)黃酮類成分對(duì)自由基有較好的清除作用。以上文獻(xiàn)研究均可說(shuō)明金盞銀盤(pán)具有明顯的抗氧化和抗炎作用。

肝纖維化是一個(gè)病理生理過(guò)程，白細(xì)胞介素-6、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基、白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子等均可能參與慢性肝損傷所致的肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展，與失常期肝硬化密切相關(guān)[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)鬼針草中總黃酮具有保肝、抗肝纖維化的作用[18]，對(duì)CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化可抑制其氧自由基的形成，從而達(dá)到治療作用[19]；本研究發(fā)現(xiàn)金盞銀盤(pán)能作用于白細(xì)胞介素-6、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基、轉(zhuǎn)錄因子p65、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子等關(guān)鍵靶點(diǎn)，并顯著投射到磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)與NF-κB兩個(gè)KEGG信號(hào)通路中，說(shuō)明金盞銀盤(pán)等鬼針草屬植物抗肝纖維化的靶點(diǎn)與信號(hào)通路是客觀存在的。

糖尿病是一種由于體內(nèi)胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足而引起的高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝疾病，常導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，如神經(jīng)病變、腦血管病變、腎病等[20-22]。其中糖尿病腎病是糖尿病微血管病變重要的并發(fā)癥，與mTOR信號(hào)通路及HIF-1信號(hào)通路等密切相關(guān)[23]，在糖尿病腎病小鼠中，HIF-1可能是導(dǎo)致腎臟纖維化和腎小球硬化的主要影響因子[24]。在糖尿病中胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特點(diǎn)，鬼針草總黃酮通過(guò)干預(yù)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)改善細(xì)胞胰島素抵抗的作用[25]；Andeysen等[26]研究表明，綠原酸類物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)有降糖作用，其機(jī)制可能與抑制葡萄糖-6-磷酸位移酶和葡萄糖吸收有關(guān)；本研究也發(fā)現(xiàn)金盞銀盤(pán)能作用于胰島素受體、腫瘤壞死因子、蛋白激酶及磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基、PKA催化亞基受體等靶點(diǎn)，參與生物代謝、內(nèi)源性刺激及調(diào)節(jié)蛋白激酶活性等GO生物過(guò)程，調(diào)控PI3K/AKT/mTOR、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、HIF-1等相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步證明金盞銀盤(pán)具有治療糖尿病及其并發(fā)癥的療效，可為深入研究其作用機(jī)制提供參考。

已有研究發(fā)現(xiàn)綠原酸具有顯著的體外抗病毒作用，對(duì)枯草桿菌、軍團(tuán)菌等能顯著抑制其生長(zhǎng)[27]，且鬼針草水提物與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用可降低其最小抑菌濃度[28]。本研究還發(fā)現(xiàn)金盞銀盤(pán)可在阿米巴病、軍團(tuán)病、甲型流感、瘧疾等KEGG通路顯著富集，推測(cè)其抑菌、抗病毒及預(yù)防感冒的作用機(jī)制可能與這些通路相關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)金盞銀盤(pán)能作用于前列腺素合成酶、Caspase-3、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)錄因子p65等靶點(diǎn)，參與催化活性、蛋白結(jié)合等分子功能，以及細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖、脂多糖調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，涉及5-羥色胺能突觸、腫瘤調(diào)控、花生四烯酸代謝、神經(jīng)退行性疾病等KEGG信號(hào)通路，因此推測(cè)金盞銀盤(pán)可能還具有抗腫瘤、抗?jié)?、治療胃腸道疾病、參與花生四烯酸代謝、對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)等作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理，對(duì)金盞銀盤(pán)提取物的主要成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)金盞銀盤(pán)不僅具有抗炎及抗氧化、對(duì)肝臟保護(hù)、治療糖尿病等藥效作用，還可能具有抗腫瘤、治療胃腸道疾病、保護(hù)心血管等作用，這對(duì)于解釋金盞銀盤(pán)的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的藥理作用提供了科學(xué)支持，為更深入研究和開(kāi)發(fā)提供了參考。