王志遠(yuǎn)，劉月環(huán)

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013)

CIP4(CDC42-interacting protein-4)為甲狀腺素受體作用因子10(thyroid hormone receptors interactor 10，TRIP10)基因表達(dá)的蛋白，是一種細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，由545氨基酸殘基組成，廣泛存在于腦、氣管、肝、腎、結(jié)腸、心、肺、前列腺等人體多種器官中，其表達(dá)受全反式維甲酸調(diào)節(jié)，作為活化的CDC42的下游，Cip4在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的形成和重排，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附，內(nèi)吞等過程中起著重要的作用，目前的研究進(jìn)展包括：(1)是EGFR的上游[1]；(2)高糖下Cip4能誘導(dǎo)腹膜上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)[2]；(3)間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)多種分化傾向并能引發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移[3]；(4)丟失Cip4蛋白會(huì)造成血小板硬膜化[4]；(5)Cip4基因敲除小鼠表現(xiàn)出餐后低血糖，胰島素抵抗，葡萄糖，轉(zhuǎn)鐵蛋白吸收下降[5]；(6)胰島素抵抗(insulin resistance,IR)的大鼠磷酸酶高表達(dá)抑制了內(nèi)臟脂肪組織中Cip4的表達(dá)[6]?，F(xiàn)已知甲狀腺素受體(Thyroxine receptor，TR，特定組織核受體之一，是一類配體激活型轉(zhuǎn)錄因子)與配體甲狀腺素(三碘甲狀腺原氨酸T3或四碘甲狀腺原氨酸T4)結(jié)合后TR構(gòu)象改變，通過與RXR(retinoic acid receptor X，維甲酸X受體)結(jié)合成二聚體來調(diào)控基因的表達(dá)，TR能夠與特定的基因DNA序列(比如甲狀腺素應(yīng)答元件)結(jié)合而發(fā)揮生理作用。RXR是核受體蛋白家族(此外還包括TR及過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)等數(shù)十種)的核心成員，在細(xì)胞發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)上處于核心地位。維甲酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中每?jī)蓚€(gè)核受體形成一個(gè)同源二聚體(RXR/RXR)或異源二聚體(RXR/RAR或PPAR/RXR或TR/RXR，加上各自的配體稱為同源或異源四聚體)，作為轉(zhuǎn)錄因子與靶基因DNA或是其上游的應(yīng)答元件結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)[7]。

長(zhǎng)爪沙鼠在高脂飼料(與高脂誘導(dǎo)大小鼠模型不同的是不需要加入抑制甲狀腺的藥物)喂養(yǎng)1周后即可形成單純性脂肪肝，2周形成脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)，4～12周即可形成不同程度的肝纖維化，12～16周出現(xiàn)肝硬化，具有成模速度快、死亡率低(成活率高于90%)、適于連續(xù)觀察非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的病理進(jìn)展的優(yōu)點(diǎn)[8]，在長(zhǎng)達(dá)十多年研究中，筆者課題組用高通量測(cè)序法檢測(cè)了高脂飼料誘導(dǎo)4周(NAFLD早期纖維化)及8月齡以上高齡(中老年)自發(fā)NAFLD(高脂血癥)長(zhǎng)爪沙鼠轉(zhuǎn)錄組，獲得了352個(gè)差異基因和32個(gè)通路，總結(jié)出NAFLD長(zhǎng)爪沙鼠模型的10大特點(diǎn)[9]。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的生信分析表明，與Cip4基因相關(guān)的通路(ko04910，胰島素信號(hào)通路)顯著上調(diào)，高脂誘發(fā)NAFLD上調(diào)大于3倍，這個(gè)結(jié)果顯示出Cip4基因有可能受甲狀腺素及甲狀腺素受體變化而發(fā)生轉(zhuǎn)錄活性變化。另外，我們也發(fā)現(xiàn)Cip4基因顯著上調(diào)與RXR低表達(dá)現(xiàn)象，但二者究竟有沒有互作關(guān)系，目前沒有明確的報(bào)道。關(guān)于Cip4基因研究較多的是其與CDC42的關(guān)系，即CDC42是Cip4上游，與細(xì)胞分裂周期密切相關(guān)[10]。Cip4作為一種受全反式維甲酸調(diào)節(jié)的甲狀腺素受體作用因子，其轉(zhuǎn)錄激活是否可直接基于上述二聚體的結(jié)合，是否需要甲狀腺素T4作為配體呢？Cip4的表達(dá)是否受配體激活型核轉(zhuǎn)錄因子及激動(dòng)劑T4的調(diào)控，且是否與RXR信號(hào)通路相關(guān)？

報(bào)告基因檢測(cè)是研究結(jié)構(gòu)基因旁側(cè)區(qū)域潛在的順式元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子等)和反式作用因子相互作用關(guān)系的一種重要工具[11]。通常是用螢火蟲熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí)，采用第二個(gè)報(bào)告基因來減少實(shí)驗(yàn)誤差。目前不少公司可以提供螢火蟲熒光素酶檢測(cè)(一般是pGL3質(zhì)粒作為載體)和海腎熒光素酶檢測(cè)(一般是pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參)組合的雙報(bào)告系統(tǒng)。在使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合pRL載體系統(tǒng)，即表達(dá)第二個(gè)報(bào)告基因海腎熒光素酶的載體系統(tǒng)，就可以在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)，較為靈敏快捷。本研究就是采用熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)Cip4的表達(dá)是否受RXR，TRB(甲狀腺素受體TR的B亞型)調(diào)控進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

腎細(xì)胞系HEK293(ATCC，自行培養(yǎng)傳代)。

1.2 主要試劑與儀器

TRB激動(dòng)劑(TRB的配體)T4(左旋甲狀腺素鈉五水合物)(Damas-beta，貨號(hào)P1081372)，DMEM(Hyclone，貨號(hào)SH30243.01B)，F(xiàn)BS(Gibco，貨號(hào)26400-044)，雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit，Promega，貨號(hào)E1910)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Thermofisher，貨號(hào)11668030)。移液器(Gilson)；離心機(jī)(Ependorf，型號(hào)5424R)；恒溫振蕩器(上海知楚，型號(hào)ZQWY-200)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，型號(hào)Forma 3111)；超速離心機(jī)(Beckman，型號(hào)Avanti J-30I)；化學(xué)發(fā)光分析儀(中生北控，型號(hào)BK-L96C)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建

通過化學(xué)合成方法將轉(zhuǎn)錄因子CDS序列克隆并構(gòu)建到pcDNA3.1表達(dá)載體上；將長(zhǎng)爪沙鼠Cip4啟動(dòng)子序列克隆并構(gòu)建到pGL3 basic的載體上(下文質(zhì)粒中標(biāo)綠的那部分)。所涉及的轉(zhuǎn)錄因子是TRB和RXR，啟動(dòng)子序列是長(zhǎng)爪沙鼠Cip4基因啟動(dòng)子區(qū)，基因克隆、合成及載體構(gòu)建均由南京一道基因公司完成，堿基序列、長(zhǎng)度及GeneBank號(hào)如下。

(1)轉(zhuǎn)錄因子TRB CDS區(qū)：長(zhǎng)爪沙鼠thyroid hormone receptor beta (TRB), transcript variant X1, mRNA(1428 bp)，NCBI參考序列為XM_021654936.1，TRB通過兩側(cè)(5’BamHI-3’EcoRI)添加酶切位點(diǎn)引入pcDNA3.1(+)，堿基序列共1464 bp，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

(2)轉(zhuǎn)錄因子RXR CDS區(qū)：長(zhǎng)爪沙鼠全部信息鏈接見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=RXR%20Gerbillinae，共有三個(gè)亞型，選取肝表達(dá)高的RXR[12]，即長(zhǎng)爪沙鼠retinoid X receptor alpha (RXRa)，transcript variant X1，mRNA，NCBI參考序列為XM_021638115.1，1404 bp，RXR-XM_021638115.1通過5’HindIII-3’XhoI克隆到pcDNA3.1(+)載體，堿基序列共1440 bp，質(zhì)粒圖譜如圖2所示。

(3)長(zhǎng)爪沙鼠Cip4啟動(dòng)子：即長(zhǎng)爪沙鼠thyroid hormone receptor interactor 10 (Trip10)，Gene ID為110545609，1426 bp，Cip4啟動(dòng)子通過在兩側(cè)引入5’NheI-3’XhoI酶切位于點(diǎn)，克隆到pGL3 basic載體，堿基序列共1438 bp，質(zhì)粒圖譜如圖3所示。

圖1 轉(zhuǎn)錄因子TRB的質(zhì)粒示意圖

圖2 轉(zhuǎn)錄因子RXR的質(zhì)粒示意圖

圖3 啟動(dòng)子Cip4的質(zhì)粒示意圖

1.3.2 TRB的配體——激動(dòng)劑甲狀腺素T4的濃度梯度實(shí)驗(yàn)

以RXR及TRB的表達(dá)量為標(biāo)記，T4設(shè)置梯度濃度為 0.1 μmol/L, 0.01 μmol/L, 0.001 μmol/L，設(shè)置24 h與48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，RXR 上游引物：5’-TGCTCATCGCCT CCTTCTCC-3’，下游引物5’-GCTCCGTCTTGT CCATCTGC-3’，片段長(zhǎng)度為177 bp；TRB上游引物：5’-GAACAGTCGTCGCCACATCTC-3’，下游引物：5’-CCTTTACATTTCTTCTCCTCCGTTTG-3’，片段長(zhǎng)度為131 bp。PCR程序?yàn)?5℃ 1 min,95℃ 15 s,60℃退火30 s，72℃延伸10 min，40個(gè)循環(huán)，99℃度保溫。取兩個(gè)基因與未加T4的空白組相比有差異的濃度為T4的工作濃度。

1.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性檢測(cè)

利用Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒，將轉(zhuǎn)錄因子和重組的質(zhì)粒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，用熒光素酶雙報(bào)告基因法檢測(cè)Cip4與RXR/TRB轉(zhuǎn)錄因子二聚體結(jié)合情況。

(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：①轉(zhuǎn)染前一天24孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在70%～80%，培養(yǎng)基為含1.3.2篩選出的工作濃度(0.01 μmol/L)T4藥物的DMEM + 10% FBS(每個(gè)分組均包括含甲狀腺素T4與不含甲狀腺素T4，下同)；②2 μL Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋到50 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，質(zhì)粒稀釋到50 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中(啟動(dòng)子+轉(zhuǎn)錄因子：TK=20∶1 總質(zhì)粒量2 μg)，混合室溫孵育20 min，補(bǔ)無血清DMEM培養(yǎng)液100 μL；③吸除皿中培養(yǎng)基，加入上一步制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物200 μL，37℃培養(yǎng)5 h；④吸除培養(yǎng)基，換0.5 mL含有1.3.2篩選出的工作濃度(0.01 μmol/L)T4藥物的完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h；⑤轉(zhuǎn)染做5次重復(fù)；⑥質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組合：第一次轉(zhuǎn)染分組如表1所示，其中pcDNA3.1、pGL3 basic為空載質(zhì)粒，pRL-TK為提供海腎熒光素酶檢測(cè)的內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒，pGL3 basic-Cip4、pcDNA3.1-TRB 分別是報(bào)告載體與TRB表達(dá)質(zhì)粒，檢測(cè)TRB對(duì)Cip4轉(zhuǎn)錄活性的影響。以上分組均包括含甲狀腺素T4和不含T4兩種處理，以檢測(cè)T4的激動(dòng)效果；第二次轉(zhuǎn)染分組如表2所示，增加了pcDNA3.1-RXR表達(dá)質(zhì)粒，第五組為檢測(cè)RXR、TRB同時(shí)存在對(duì)Cip4轉(zhuǎn)錄活性的影響，其余同上(亦包括含甲狀腺素T4和不含T4兩種處理，以檢測(cè)T4的激動(dòng)效果)。

表1 TRB增強(qiáng)Cip4啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄作用的質(zhì)粒分組

表2RXR、TRB對(duì)Cip4啟動(dòng)作用的質(zhì)粒分組

Table2Plasmid grouping of RXR and TRB on the initiation ofCip4

序號(hào)No.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組合Plasmid groups1pcDNA3.1 + pGL3 basic + pRL-TK2pcDNA3.1 + pGL3 basic-Cip4 + pRL-TK3pcDNA3.1-RXR + pGL3 basic + pRL-TK4pcDNA3.1-RXR + pGL3 basic-Cip4 + pRL-TK5pcDNA3.1-RXR + pcDNA3.1-TRB + pGL3 basic-Cip4+ pRL-TK

(2)雙熒光素酶檢測(cè)：①裂解細(xì)胞：每孔中加入細(xì)胞裂解液200 μL，室溫孵育10 min，充分裂解細(xì)胞；②收裂解液10 000 r/min離心5 min，取上清作為待測(cè)液；③溶解螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑和海腎螢光素酶檢測(cè)緩沖液，并達(dá)到室溫。海腎螢光素酶檢測(cè)底物(100×)置于冰浴或冰盒上備用；④按儀器操作說明書開啟化學(xué)發(fā)光儀，取100 μL裂解液上清加入96孔發(fā)光板中，加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測(cè)工作液，吹吸混勻；⑤上機(jī)測(cè)發(fā)光值，激發(fā)時(shí)間5 s；⑥加入海腎熒光素酶檢測(cè)工作液100 μL，吹吸混勻，上機(jī)測(cè)發(fā)光值，激發(fā)時(shí)間5 s；⑦在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測(cè)定得到的RLU值除以海腎螢光素酶測(cè)定得到的RLU值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間報(bào)告基因的活化程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 T4濃度影響RXR、TRB的表達(dá)量

T4刺激后RXR、TRB兩個(gè)基因表達(dá)的qPCR結(jié)果分析繪制圖4～6，從圖上可以看出，0.1 μmol/L，1 μmol/L的T4刺激HEK293T在24 hr及48 hr后，兩個(gè)基因表達(dá)均無差異，而用 0.01 μmol/L的T4刺激HEK293T后，TRB、RXR在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出一定的差異，RXR表達(dá)量趨于增加，而TRB表達(dá)量趨于下降，鑒于RXR與TRB的表達(dá)量的差異，從實(shí)驗(yàn)的目的出發(fā)，選取0.01 μmol/L的T4作為下一步實(shí)驗(yàn)的工作濃度。

2.2 TRB的啟動(dòng)作用檢測(cè)

根據(jù)計(jì)算測(cè)定的活性值進(jìn)行繪圖，如圖7所示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，從實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的熒光素酶相對(duì)活性顯示，TRB的共轉(zhuǎn)沒有提高Cip4啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄活性(P>0.05)。

2.3 RXR與TRB對(duì)Cip4的啟動(dòng)作用

根據(jù)計(jì)算測(cè)定的活性值進(jìn)行繪圖，如圖8所示，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，從實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的熒光素酶相對(duì)活性顯示，RXR的共轉(zhuǎn)提高Cip4啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.001)，但RXR、TRB兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)，在甲狀腺素T4激動(dòng)的情況下Cip4活性較RXR單獨(dú)存在的情況下顯著下降(P<0.01)。

圖4 0.01 μmol/L T4刺激24 h(左)或48 h(右)的HEK293T中RXR與TRB的基因表達(dá)量

圖5 0.1 μmol/L T4刺激24 h(左)或48 h(右)的HEK293T中RXR與TRB的基因表達(dá)量

圖6 1 μmol/L T4刺激24 h(左)或48 h(右)的HEK293T中RXR與TRB的基因表達(dá)量

注：各組質(zhì)粒組合均含pRL-TK。*P < 0.05；“ns”表示差異無顯著性。

注：各組質(zhì)粒組合均含pRL-TK。*P< 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；“ns”表示差異無顯著性。

3 討論

報(bào)告基因系統(tǒng)是把編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，通過檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物(精確定量熒光信號(hào))來標(biāo)定目的基因表達(dá)的調(diào)控情況[13]。該技術(shù)具有實(shí)時(shí)定量性、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等等優(yōu)點(diǎn)，因此在啟動(dòng)子活性分析、基因轉(zhuǎn)移及表達(dá)分析、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究、大分子互作等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[14]。

本研究是在獲得長(zhǎng)爪沙鼠Cip4基因啟動(dòng)子序列的基礎(chǔ)上，將Cip4基因啟動(dòng)子序列以化學(xué)合成的方式插入到熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中,然后和以相同方式構(gòu)建在pCDNA3.1上的長(zhǎng)爪沙鼠兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子TRB、RXR、TK的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞檢測(cè)其熒光素酶活性，并將這個(gè)組成型Cip4基因啟動(dòng)序列全長(zhǎng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與T4共孵育，確定了T4、TRB與RXR對(duì)Cip4基因的啟動(dòng)及調(diào)控作用。研究結(jié)果表明：?jiǎn)渭兗尤隩RB(T4受體)并不能改變Cip4的轉(zhuǎn)錄水平(P>0.05)，但單純加入RXR，可以明顯改變Cip4的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，在T4 的作用下是可以明顯上調(diào)Cip4的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.001)，這證實(shí)了RXR可以優(yōu)先與Cip4結(jié)合[15-16]，同時(shí)表明T4對(duì)Cip4有本底調(diào)控作用或存在其他不依賴TRB(或稱為非經(jīng)典)的調(diào)控途徑。TRB是在啟動(dòng)子區(qū)與Cip4-RXR復(fù)合物結(jié)合的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，TRB受T4的激動(dòng)后，Cip4活性變化明顯(P<0.05)，這符合配體激活型轉(zhuǎn)錄因子的特征[15]。如果有RXR，TRB共同存在的情況下，Cip4的轉(zhuǎn)錄水平是受到更嚴(yán)格的下調(diào)(共調(diào)節(jié))(P<0.01)[17-18]?，F(xiàn)已知代謝性疾病中，核轉(zhuǎn)錄因子中RXR、PPAR、TRB等轉(zhuǎn)錄因子在靶基因轉(zhuǎn)錄激活中所起的作用是不相同的，一般情況下RXR和PPAR是占主要地位(核心地位)的核轉(zhuǎn)錄因子，其數(shù)量在正常與應(yīng)激情況下都占多數(shù)[19-20]。本研究中T4濃度選擇亦是考慮二種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)T4的激動(dòng)出現(xiàn)表達(dá)量差異時(shí)(即對(duì)二種受體轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)不同，類似于依賴或不依賴型途徑)的最佳濃度為首選[21]，T4主要是TRB的激動(dòng)劑，因此選擇了0.1 μmol/L。

熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與共價(jià)靶啟動(dòng)子中的特異性序列結(jié)合的重要手段，也是目前配體激活型轉(zhuǎn)錄因子(如miRNA，激動(dòng)劑，抑制劑及其他環(huán)境影響要素等)的作用研究中常用的方法[22-23]。本研究提供了T4、TRB及RXR調(diào)控長(zhǎng)爪沙鼠Cip4基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的證據(jù)，間接模擬了配體激活型轉(zhuǎn)錄因子RXR-TRB異源二聚體在配體T4存在對(duì)Cip4的轉(zhuǎn)錄活化現(xiàn)象[24]，也證實(shí)了Cip4的轉(zhuǎn)錄活化與RXR信號(hào)通路密切相關(guān)。對(duì)單一靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式，所建立雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)也適用于其他受核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因。另外本研究中用甲狀腺素作為激動(dòng)劑(配體)的實(shí)驗(yàn)為揭示長(zhǎng)爪沙鼠NAFLD模型的特色及甲狀腺素在人類NAFLD發(fā)病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。