卜蘭蘭，金 劍，李思迪，劉新民

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，長沙 410208；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州 451200；3.吉首大學(xué)，湖南 吉首 416000；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

流行病學(xué)調(diào)查顯示，國人睡眠障礙發(fā)生率很高，有睡眠障礙者約占38%，高于世界27%的比例，嚴(yán)重影響人們健康[1]。睡眠干擾對機(jī)體的影響十分明顯，包括學(xué)習(xí)記憶、精神情緒、運(yùn)動表現(xiàn)、生物鐘、免疫、能量平衡等多方面[2-6]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，滾筒法睡眠干擾可造成小鼠學(xué)習(xí)能力下降、抑郁、疲勞以及大鼠運(yùn)動行為異常[6-13]。但滾筒法不同程度睡眠干擾對大鼠的步態(tài)運(yùn)動及認(rèn)知能力影響如何，尚未見報(bào)道。本研究旨在觀察滾筒法不同時(shí)長睡眠干擾后大鼠步態(tài)、認(rèn)知能力的變化特征，動態(tài)分析不同時(shí)長睡眠干擾對SD大鼠步態(tài)及認(rèn)知能力的影響，為睡眠干擾機(jī)制及防護(hù)措施研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮u價(jià)指標(biāo)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠64只，雄性，體重220 ～ 240 g，6 ～ 8周齡，購自北京維通利華公司[SCXK (京)2016-0006]。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所進(jìn)行[SYXK (京)2018-0020]。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)動物管理與動物福利委員會審查批準(zhǔn)(倫理委員會審批號：SLXD-201803170028)。實(shí)驗(yàn)遵守3R原則，國際實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。動物自由攝食攝水，實(shí)驗(yàn)室安靜，溫度22℃ ～ 24℃，濕度40% ～ 60%，12 h照明/12 h黑暗。

1.2 主要儀器

滾筒式大小鼠睡眠干擾儀、大鼠自主活動儀、大鼠Morris水迷宮、大小鼠步態(tài)分析儀由北京鑫海華儀公司、中國航天員科研訓(xùn)練中心及中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研發(fā)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按體重隨機(jī)分為睡眠干擾2 d、5 d、10 d、15 d模型組及相應(yīng)對照組，共8組，每組8只。

1.3.2 睡眠干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在滾筒式大小鼠睡眠干擾儀[6-14]中進(jìn)行。先適應(yīng)，后造模。

適應(yīng)：睡眠干擾組大鼠放入滾筒，滾動參數(shù)1 r/min、轉(zhuǎn)5圈休息1 min，每天3 h，連續(xù)3 d。

造模：睡眠干擾組大鼠放入滾筒，滾動參數(shù)1 r/min、轉(zhuǎn)5圈休息1 min[11]，開始運(yùn)轉(zhuǎn)。2 d、5 d、10 d、15 d時(shí)取出相應(yīng)模型組和對照組進(jìn)行行為學(xué)檢測。

1.3.3 自主活動實(shí)驗(yàn)

大鼠自主活動儀[9-11, 14]由4個(gè)可移動圓桶(直徑75 cm，高50 cm)和圖像采集分析系統(tǒng)組成。圓桶正上方的攝像頭能自動監(jiān)測動物的運(yùn)動軌跡并將信息傳送至計(jì)算機(jī)。圓桶底部活動場所被軟件分為三個(gè)區(qū)即中央?yún)^(qū)(中心直徑20 cm)、邊緣區(qū)(周邊寬10 cm)、探索區(qū)(中央與邊緣區(qū)之間)。睡眠干擾相應(yīng)時(shí)間到，取出相應(yīng)模型組和對照組。設(shè)定參數(shù)后，迅速將動物沿壁放入桶內(nèi)，軟件采集動物10 min的軌跡，并通過總路程、平均速度、運(yùn)動總時(shí)間、中央?yún)^(qū)運(yùn)動時(shí)間、邊緣區(qū)運(yùn)動時(shí)間等反映動物活動情況。

1.3.4 步態(tài)實(shí)驗(yàn)

大小鼠步態(tài)分析儀[9, 11-12, 17]由裝有高頻攝像頭的步行通道、足跡增強(qiáng)板、背景增強(qiáng)裝置、圖像采集分析系統(tǒng)等組成(見圖1)。光線從熒光管中發(fā)出，透過玻璃平板，當(dāng)動物腳掌與玻璃平板表面接觸時(shí)，光線向下反射，下方的高頻攝像頭捕捉到腳印圖像。該系統(tǒng)全程采集動物行走時(shí)的足印信息，分析足跡的步行周期、支撐距離、支撐時(shí)長、擺動時(shí)長、制動時(shí)長、推進(jìn)時(shí)長、步頻等97種指標(biāo)，可客觀、準(zhǔn)確、全面地反映動物步態(tài)的變化情況[12]。

注：1：視頻采集分析系統(tǒng)；2：動物步行通道；3：高速攝像機(jī)；4：足跡增強(qiáng)板；5：背景增強(qiáng)裝置。

為使大鼠能在正式實(shí)驗(yàn)中恒速無停頓地通過步態(tài)儀的通道，必須對其進(jìn)行規(guī)范的前期訓(xùn)練。在睡眠干擾前，對所有大鼠進(jìn)行步態(tài)訓(xùn)練，每天3次，連續(xù)1周。睡眠干擾相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)到，自主活動檢測后，對其進(jìn)行步態(tài)檢測。

檢測前，調(diào)試儀器采光系統(tǒng)，在適當(dāng)?shù)墓饩€條件下，保證大鼠足印在采集圖像窗口中清晰可見，每只大鼠不間斷連續(xù)跑過步行通道時(shí)，高頻攝像機(jī)記錄步態(tài)錄像，并通過計(jì)算機(jī)分析軟件進(jìn)行圖像分析，統(tǒng)計(jì)步態(tài)指標(biāo)。

1.3.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

睡眠干擾相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)到，自主活動和步態(tài)實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。

大鼠Morris水迷宮[9, 11, 15-16, 18]由一個(gè)直徑180 cm、高38 cm的圓形水池及圖像采集分析系統(tǒng)組成[11]。平臺直徑6 cm、高13 cm，水深15 cm。實(shí)驗(yàn)分為定位航行和空間探索兩個(gè)階段。定位航行歷時(shí)5 d，空間探索歷時(shí)1 d。檢測時(shí)間設(shè)定為120 s。具體實(shí)驗(yàn)方法同前期實(shí)驗(yàn)[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)長睡眠干擾對SD大鼠自主活動的影響

如表1所示，與相應(yīng)對照組比較，5 d模型組總路程、平均速度、運(yùn)動總時(shí)間、邊緣區(qū)運(yùn)動時(shí)間明顯減少(P< 0.05)，靜息總時(shí)間明顯增加(P< 0.05)；10 d模型組總路程、平均速度明顯減少(P< 0.05)，運(yùn)動總時(shí)間、邊緣區(qū)運(yùn)動時(shí)間顯著減少(P< 0.01)，靜息總時(shí)間顯著增加(P< 0.01)。

2.2 不同時(shí)長睡眠干擾對SD大鼠步態(tài)行為的影響

如圖2所示，與對照組比較，2 d模型組大鼠步行速度明顯下降、雙支撐時(shí)相-左前-右后明顯縮短、右后步幅明顯縮小、體轉(zhuǎn)角標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯減小(P< 0.05)，三支撐時(shí)相-右后-左后-右前顯著增加(P< 0.01)，雙支撐時(shí)相-左后-右前顯著縮短(P< 0.01)；5 d模型組大鼠平均步行周期明顯縮短、右后推進(jìn)時(shí)長明顯減少(P< 0.05)，右后步幅顯著縮小(P< 0.01)；15 d模型組大鼠步行速度明顯下降、右后步幅明顯縮小、雙支撐時(shí)相-左前-右后明顯縮短、右后推進(jìn)時(shí)長明顯減少(P< 0.05)，三支撐時(shí)相-右后-左后-右前顯著增加(P< 0.01)，雙支撐時(shí)相-左后-右前和右后推進(jìn)指數(shù)顯著縮短(P< 0.01)。

2.3 不同時(shí)長睡眠干擾對SD大鼠水迷宮的影響

如表2所示，與對照組比較，5 d模型組大鼠定位航行第1 ～ 4天潛伏期增加(P< 0.05)；10 d模型組大鼠定位航行第2、4天潛伏期明顯增加(P< 0.05)；15 d模型組大鼠定位航行第1 ～ 5天潛伏期明顯增加(P< 0.05)，其中5 d模型組大鼠定位航行第1天潛伏期顯著增加(P< 0.01)，15 d模型組大鼠定位航行第1 ～ 3天潛伏期顯著增加(P< 0.01)；2 d模型組大鼠定位航行第4天潛伏期顯著減少(P< 0.01)。如表3所示，與相應(yīng)對照組比較，2 d、5 d、10 d、15 d模型組大鼠空間探索各指標(biāo)差異無顯著性(P> 0.05)。

表1 睡眠干擾對SD大鼠自主活動的影響

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。下圖、下表同。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.The same in the following figure and tables.

圖2 睡眠干擾對SD大鼠步態(tài)行為的影響

Table2Effects of sleep interruption on latency in the Morris water maze test (place navigation)in SD rats

時(shí)間Time2 d5 d10 d15 d對照組Control group模型組Model group對照組Control group模型組Model group對照組Control group模型組Model group對照組Control group模型組Model group第1天Day 166.41±28.9459.93±18.4548.90±23.1297.03±26.97??64.72±23.9982.75±27.6651.48±19.0398.05±28.27??第2天Day 218.91±7.2430.22±20.5633.35±16.8066.04±18.40?24.67±12.2447.69±21.15?26.36±10.7966.56±27.67??第3天Day 318.06±10.1315.60±9.8420.29±10.2359.20±13.25?20.54±13.9837.64±17.4114.51±4.3243.59±17.22??第4天Day 429.50±17.2214.73±5.63?10.95±3.4151.50±18.21?14.13±7.5733.78±12.90?12.61±4.3830.79±16.61?第5天Day 516.72±6.6716.21±10.6611.58±4.7629.86±15.0419.67±13.0512.27±7.0813.55±8.5832.61±19.78?

表3 睡眠干擾對SD大鼠水迷宮(空間探索)成績的影響

3 討論

水迷宮和自主活動分別是評價(jià)嚙齒類動物空間認(rèn)知和探索行為的經(jīng)典方法[19-20]。不同方法、不同程度睡眠干擾對學(xué)習(xí)記憶有不同程度損害，對探索運(yùn)動行為有不同的影響[21-24]。以前期研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，我們探索性地研究了2 d、5 d、10 d、15 d睡眠干擾對SD大鼠認(rèn)知能力及探索運(yùn)動行為的影響。本研究顯示，滾筒法短時(shí)長睡眠干擾(2 d)大鼠空間定位學(xué)習(xí)能力有一過性提高，但隨干擾時(shí)間延長，學(xué)習(xí)能力下降。干擾初期(2 d)、后期(15 d)自主活動指標(biāo)無差異，與干擾時(shí)間短或大鼠對滾筒產(chǎn)生適應(yīng)有關(guān)；干擾中間階段(5 d、10 d)運(yùn)動探索減少，表明興奮性下降。不同時(shí)長睡眠干擾，水迷宮、自主活動結(jié)果與我們前期研究一致[10-11]。這表明滾筒法睡眠干擾結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

步態(tài)指機(jī)體步行時(shí)的姿勢和運(yùn)動。機(jī)體對行走過程中步態(tài)的調(diào)控極其復(fù)雜，步行高級中樞的定位和其對步態(tài)的調(diào)控方式至今尚未明了，據(jù)推測大腦皮質(zhì)、腦干和小腦均存在步行調(diào)控中樞，當(dāng)其受損或傳導(dǎo)通路發(fā)生障礙時(shí)，可能導(dǎo)致不同類型的異常步態(tài)[12]。目前，步態(tài)研究主要集中在帕金森病、腦卒中、老年癡呆、腦癱、周圍神經(jīng)損傷、骨關(guān)節(jié)病損等的評價(jià)[25-29]。而睡眠干擾動物行為學(xué)研究及評價(jià)集中在學(xué)習(xí)記憶、抑郁、焦慮、疲勞等方面[6-10, 13, 30]。有關(guān)睡眠干擾所致步態(tài)異常的系統(tǒng)性研究報(bào)道非常少，僅見有應(yīng)用藥物注射模擬失眠的報(bào)道一篇[31]。化學(xué)法干擾睡眠雖簡單易行，但化學(xué)藥品多屬精神藥品受到嚴(yán)格管制，睡眠干擾效果和程度會因動物個(gè)體差異而不易掌握，也會由于注射藥物的時(shí)間長短及量的多少而出現(xiàn)差異，且造模藥物可能干擾實(shí)驗(yàn)藥物的藥效學(xué)研究，故應(yīng)用較少[11]。滾筒法睡眠干擾通過滾筒滾動，使筒內(nèi)動物被打擾而保持清醒，因造模方法簡單、效果明顯、穩(wěn)定性和重復(fù)性好而在睡眠干擾模型制作和研究中廣泛應(yīng)用[6-13, 30]。但滾筒法不同時(shí)長睡眠干擾對動物步態(tài)的影響尚未見報(bào)道。

本研究動態(tài)觀察和分析了滾筒法不同時(shí)長睡眠干擾SD大鼠的步態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨干擾時(shí)間的延長，SD大鼠出現(xiàn)了不同特點(diǎn)的步態(tài)功能異常。首先，雙支撐時(shí)相減少、三支撐時(shí)相增加，提示大鼠行走穩(wěn)定性下降，為提高行走穩(wěn)定性而增加多肢體支撐時(shí)相。平均體轉(zhuǎn)角標(biāo)準(zhǔn)偏差在干擾初期發(fā)生顯著變化，說明干擾初期大鼠行走方向雖未偏移，但左右搖擺幅度增大，行走穩(wěn)定性下降，這與雙支撐時(shí)相減少、三支撐時(shí)相增加反映情況相一致。平均體轉(zhuǎn)角標(biāo)準(zhǔn)偏差只在干擾初期出現(xiàn)，多支撐時(shí)相在干擾初期和后期均有變化，提示干擾初期步態(tài)穩(wěn)定性下降程度更大。推進(jìn)時(shí)長和推進(jìn)指數(shù)是肢體蹬地啟動、身體移動指標(biāo)，反映行走時(shí)肢體發(fā)力。睡眠干擾中間較早時(shí)(5 d)和干擾后期推進(jìn)時(shí)長或推進(jìn)指數(shù)下降，提示肢體支撐力減弱，這也是大鼠移動速度下降重要原因之一。其次，睡眠干擾大鼠步行速度、雙支撐時(shí)相、三支撐時(shí)相、后肢推進(jìn)時(shí)長在干擾初期和后期均顯著下降，而中間階段(5 d、10 d)未見差異。這與干擾初期睡眠時(shí)間突然減少，機(jī)體處于急性應(yīng)激狀態(tài)，之后機(jī)體啟動代償機(jī)制，但隨應(yīng)激持續(xù)(至15 d)，最終表現(xiàn)為失代償有關(guān)。因此滾筒法(1 r/min，連續(xù)5 r，間隔1 min)不同時(shí)長睡眠干擾對雄性SD大鼠步態(tài)的影響呈現(xiàn)“損傷-代償性恢復(fù)-失代償性損傷”的規(guī)律。應(yīng)用步態(tài)分析儀對滾筒法不同時(shí)長睡眠干擾大鼠進(jìn)行系統(tǒng)全面的步態(tài)指標(biāo)分析，在睡眠干擾動物模型評價(jià)中尚未見報(bào)道。步態(tài)異常機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

評價(jià)睡眠干擾模型時(shí)，我們用步態(tài)、自主活動、水迷宮分別評價(jià)SD大鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)能力、探索運(yùn)動行為和空間認(rèn)知能力。通過分析發(fā)現(xiàn)，滾筒法睡眠干擾模型對SD大鼠步態(tài)、自主活動、空間定位學(xué)習(xí)能力有不同程度的影響。從指標(biāo)方面看，潛伏期指標(biāo)較為單一，自主活動指標(biāo)只有在中間階段才顯示造模對SD大鼠探索運(yùn)動行為的影響，不夠敏感。而步態(tài)檢測可靈敏地探測到動物運(yùn)動協(xié)調(diào)能力的改變，在睡眠干擾模型行為學(xué)評價(jià)中指標(biāo)類型較多，且無創(chuàng)。本研究為睡眠干擾模型評價(jià)篩選到更敏感的行為學(xué)評價(jià)方法，可為睡眠干擾程度及相關(guān)藥物研發(fā)提供好的行為學(xué)方法，為睡眠干擾疾病模型的機(jī)制研究、藥效學(xué)評價(jià)選擇合適的時(shí)間窗提供依據(jù)，也為從睡眠方面入手、科學(xué)地干預(yù)機(jī)體運(yùn)動能力提供好的動物模型，為防護(hù)產(chǎn)品研發(fā)提供參考。