范新昊，田發(fā)明，王婧瑤，張 楠，遲博婧，張國彬*，郭志斌

(1.開灤總醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000；3.開灤總醫(yī)院林西礦醫(yī)院，河北 唐山 063000)

一定的負(fù)荷刺激對于維持骨穩(wěn)態(tài)和骨骼健康至關(guān)重要，適當(dāng)應(yīng)力刺激如體育鍛煉可促進(jìn)骨形成[1]，而失用造成的負(fù)荷刺激缺失往往會造成肌肉萎縮和骨量丟失，研究表明，長期臥床、癱瘓或航天飛行導(dǎo)致每月1%～2%的骨量丟失[2]。目前對于該類骨丟失的治療仍以二磷酸鹽類藥物為主，可以通過抑制骨吸收降低骨轉(zhuǎn)換率部分抑制宇航員骨量下降，但該類藥物對促進(jìn)骨形成的作用有限[3]。如果在干預(yù)方案中考慮抑制骨吸收與促進(jìn)骨形成藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能療效會優(yōu)于單純抑制骨吸收，也更適用于防治失用導(dǎo)致的骨丟失。

辛伐他汀是目前一線降血脂藥物，其成骨作用潛能近年來備受關(guān)注。課題組前期研究證實(shí)辛伐他汀單純體內(nèi)干預(yù)雖表現(xiàn)出一定的骨保護(hù)作用[4]，但僅對大鼠股骨近端的骨丟失有抑制作用，如果聯(lián)合應(yīng)用骨吸收抑制劑如利塞膦酸鈉，能否取得更好效果，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。基于以往研究，不同性質(zhì)的骨代謝調(diào)節(jié)劑聯(lián)合應(yīng)用有可能取得更好的抗骨質(zhì)疏松的作用[5]，我們推測辛伐他汀與利塞膦酸鈉聯(lián)合應(yīng)用可以抑制失用性骨丟失，并較單獨(dú)用藥具有更好的效果。本研究 擬通過尾懸吊法建立小鼠失用性骨丟失模型，并給予辛伐他汀和或利塞膦酸鈉干預(yù)，觀察單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥的干預(yù)效果，以期為進(jìn)一步探索相關(guān)干預(yù)方案和作用機(jī)制等后續(xù)研究乃至相關(guān)臨床干預(yù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究應(yīng)用SPF級12周齡雄性C57BL/6小鼠30只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK (京)2017-0001]，體重(25±3)g，所有小鼠在華北理工大學(xué)動物中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)[SYXK (冀)2015-0038]。本研究中涉及實(shí)驗(yàn)動物的處理和干預(yù)，均符合華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定，動物實(shí)驗(yàn)倫理審查證明編號為：LX201809，并遵照實(shí)驗(yàn)動物使用的3R(減少、替代、優(yōu)化)原則給予人道關(guān)懷。制備模型與處死時應(yīng)用小動物多功能麻醉機(jī)進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，麻醉藥物為異氟烷，氣體流量500 mL/min，濃度1.5%，處死時與其他動物隔離。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(深圳市銳沃德生命科技有限公司)；利塞膦酸鈉(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)；辛伐他汀(浙江瑞邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；TRIzol(Invitrogen，美國)；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)；小鼠OPG(美國Abcam公司)、RANKL抗體(美國Santa Cruz公司)、山羊抗兔二抗(美國SAB公司)。微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT，Skyscan，比利時)；AG-IS型萬能試驗(yàn)機(jī)統(tǒng)(日本島津公司)；PCR儀(Applied biosystems美國)；小動物多功能麻醉機(jī)(ZS-MV-I，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組及處理

所有小鼠隨機(jī)分成5組，每組6只：對照組(A組)、模型組(B組)、辛伐他汀組(C組)、利塞膦酸鈉組(D組)和聯(lián)合干預(yù)組(E組)。除A組外，其余各組小鼠均采用尾部懸吊(軀體與地面呈40°左右角度，以后肢伸直不能著地為準(zhǔn))制備尾懸吊擬失重模型，分別給予生理鹽水(B組)，辛伐他汀(5 mg/(kg·d)，C組)、利塞膦酸鈉(1 mg/(kg·d)，D組)和兩者聯(lián)合(E組)灌胃干預(yù)，3周后異氟烷麻醉處死取材。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時各組均無小鼠死亡，所有動物納入最終指標(biāo)分析和結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 Micro-CT分析

應(yīng)用Sky Scan 1076 Micro-CT 對小鼠左側(cè)脛骨進(jìn)行掃描檢測，收集數(shù)據(jù)，并利用Micro-CT 配套軟件對掃描圖像進(jìn)行三維重建及結(jié)果分析。脛骨近端松質(zhì)骨興趣區(qū)為上端生長板下0.5～2 mm，皮質(zhì)骨內(nèi)側(cè)的松質(zhì)骨；脛骨中段皮質(zhì)骨感興趣區(qū)為脛腓骨連接處上方1 mm。松質(zhì)骨檢測指標(biāo)有: 骨容積率(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(Structure Model Index, SMI)。皮質(zhì)骨檢測指標(biāo)BV /TV、皮質(zhì)骨厚度(Cortical bone thickness，Ct.Th)。

1.3.3 生物力學(xué)檢測

取所有小鼠的右側(cè)股骨行生物力學(xué)分析，采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，支點(diǎn)跨距(L)為6 mm，中央垂直(股骨與載荷成90°角)加載負(fù)荷，速率5 mm/min，直至股骨斷裂，記錄并分析最大壓縮載荷及彈性模量。

1.3.4 聚合酶鏈反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后提取小鼠右側(cè)脛骨，制備組織勻漿，采用TRIzol法提取總RNA，應(yīng)用TaKaRa試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時熒光光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測OPG和RANKL的表達(dá)。配制反應(yīng)液：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.8 μL Forward Primer，0.8 μL Reverse Primer，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，2 μL cDNA，6 μL滅菌水，總體系為20 μL；Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 34 s，共40個循環(huán)；記錄各標(biāo)本擴(kuò)增的Ct值，以2-ΔΔCt作為統(tǒng)計(jì)數(shù)值，檢測各基因與內(nèi)參基因GAPDH的比值，得出目的基因表達(dá)的相對含量，公式如下：ΔΔCt=Ct處理組(目的基因-內(nèi)參基因)-Ct對照組(目的基因-內(nèi)參基因)。引物序列OPG 上游5’-TTTCTTCTGGGCTGATCTTCTTCC-3’，下游5’-CATCCAAGACATTGACCTCTCTTGA-3’；RANKL 上游5’-CTGATGAAAGGAGGGAGCACG-3’，下游 5’-GGAAGGGTTGGACACCTGAATG-3’；GAPDH 上游5’-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3’，下游5’-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGTT-3’。

1.3.5 Western blot

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，提取各組小鼠右側(cè)股骨總蛋白，采用BCA定量蛋白，根據(jù)測定蛋白濃度計(jì)算上樣量，經(jīng)電泳及轉(zhuǎn)膜后，取出PVDF膜置于TBST配制的5%脫脂奶粉中孵育、漂洗2 h，完成對非特異性抗原的封閉。封閉結(jié)束后將膜與OPG抗體(1∶200)或RANKL(1∶200)抗體孵育，4℃過夜。次日加入IgG二抗稀釋液(1∶1000)中，37℃搖床孵育2 h，然后置于TBST緩沖液搖床漂洗，控干TBST后，用ECL顯色液顯色，待蛋白條帶清晰后立刻取出PVDF膜，置于清水中終止顯色。采用Image J軟件進(jìn)行圖像灰度掃描測定，測定目的蛋白OPG、RANKL與內(nèi)參蛋白β-actin的OD值，計(jì)算兩者比值作為其相對表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT檢測結(jié)果

各組小鼠脛骨中段皮質(zhì)骨及脛骨近端松質(zhì)骨的micro-CT三位重建圖如圖1所示。相關(guān)參數(shù)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果如下：皮質(zhì)骨：骨容積率比較，B、C、D、E組均顯著低于A組(P<0.05)；E組顯著高于B、C、D組(P<0.05)，其余組間比較無顯著差別(P>0.05)。皮質(zhì)骨厚度，B、C組顯著低于A組(P<0.05)，E組顯著高于B、C組(P<0.05)，其余組間比較沒有顯著差異(P>0.05)。見表1。

脛骨近端松質(zhì)骨分析結(jié)果：骨容積率：B、C、D、E組顯著低于A組(P<0.05)；C、D組顯著高于B組(P<0.05)，E組顯著高于B、C、D組(P<0.05)；骨小梁數(shù)量：B、C、D組顯著低于A、E組(P<0.05)；骨小梁厚度：B組顯著低于A組(P<0.05)，C、D、E組顯著高于B組(P<0.05)；骨小梁分離度B、C、D組顯著高于A、E組(P<0.05)；結(jié)構(gòu)模型指數(shù)B、C、D、E組顯著低于A組(P<0.05)。見表2。

2.2 生物力學(xué)

最大載荷：B、C、D、E組顯著低于A組(P<0.05)，E組顯著高于B組(P<0.05)，其余各組間兩兩比較無顯著差別(P<0.05)；彈性模量：B、C、D組顯著低于A組(P<0.05)，B、E組顯著高于B組(P<0.05)，其余各組間兩兩比較無顯著差別(P<0.05)。見表3。

圖1 小鼠脛骨micro-CT三維重建圖

Table1Results of micro-CT of cortical bone in the middle shaft of the tibia

指標(biāo)Indices對照組(A組)Control group(group A)模型組(B組)Tail suspension group(group B)辛伐他汀組(C組)Simvastatin treatmentgroup (group C)利塞膦酸鈉組(D組)Risedronate sodiumtreatment group (group D)聯(lián)合治療組(E組)combined treatmentgroup (group E)骨容積率(%)BV/TV0.69±0.020.61±0.02a0.63±0.03a0.63±0.02a0.66±0.03abcd皮質(zhì)骨厚度(μm)Ct.Th230.3±11213.7±10.5a214.8±8.5a225.1±14.8231±13.1bc

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.Compared with the group C,cP<0.05.Compared with the group D,dP<0.05.

表2 脛骨近端松質(zhì)骨micro-CT分析結(jié)果

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.Compared with the group C,cP<0.05.Compared with the group D,dP<0.05.

2.3 PCR檢測結(jié)果

實(shí)時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，OPG的mRNA表達(dá)在C、E組顯著高于B組(P<0.05)，其余組間比較未見顯著差異(P<0.05)；RNAKL在B組表達(dá)顯著高于A組(P<0.05)，其余組間比較未見顯著差異(P<0.05)。見表4。

2.4 Western blot檢測結(jié)果

Western blot分析OPG、RANKL蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：OPG在A組的表達(dá)顯著高于其余各組(P<0.05)，E組顯著高于B組(P<0.05)；RANKL在A組的表達(dá)顯著低于其余各組(P<0.05)。如圖2所示。

3 討論

失用性骨質(zhì)疏松在臨床中多見于長期臥床的患者，骨量丟失、肌肉力量減弱和協(xié)調(diào)性下降會增加骨折風(fēng)險。而一旦發(fā)生骨折，往往對患者乃至其家庭帶來沉重打擊，目前對于失用性骨質(zhì)疏松的重視程度仍亟待提高，其有效防治方案也在積極探索中。通過對小鼠尾部懸吊離地，導(dǎo)致后肢應(yīng)力缺失是目前常用的模擬失用性骨質(zhì)疏松的動物模型[6-7]。本研究經(jīng)過三周尾懸吊成功制備了該小鼠模型，Micro-CT分析發(fā)現(xiàn)該模型小鼠骨量下降，微結(jié)構(gòu)退變，蛋白水平RANKL表達(dá)水平上調(diào)，OPG水平下調(diào)，提示該模型同時伴有骨形成下降和骨吸收活性增強(qiáng)，這也與部分研究結(jié)果一致[8-9]，由于失重導(dǎo)致的骨細(xì)胞凋亡分泌更多的RANKL是該模型骨吸收活躍并導(dǎo)致骨丟失的重要機(jī)制[9]。

表3 生物力學(xué)檢測結(jié)果

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.

表4 PCR檢測結(jié)果

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

他汀類藥物，尤其是水溶性他汀類藥物，除了降脂外，其他潛在作用也日益收到關(guān)注，其促進(jìn)骨形成潛能目前已初步得到認(rèn)可[10-12]，課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可部分阻止尾懸吊大鼠股骨近端骨丟失，但未能達(dá)到正常對照組水平，本研究中我們發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀作用3周可部分組織小鼠脛骨近端松質(zhì)骨的骨丟失，但對脛骨中段皮質(zhì)骨丟失的抑制作用并不顯著。但是mRNA水平對OPG和RANKL的分析發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可有效促進(jìn)OPG在mRNA水平的表達(dá)，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)對蛋白水平的表達(dá)影響并不顯著。鑒于蛋白水平不僅僅取決于生產(chǎn)效率及mRNA翻譯過程，也同樣收到降解相關(guān)因素的影響，因此雖然我們在該單一節(jié)點(diǎn)提取的蛋白表達(dá)水平為觀測到顯著差異，但mRNA表達(dá)水平的升高也初步提示了辛伐他汀的促進(jìn)骨形成作用。辛伐他汀對OPGmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用和對RANKLmRNA抑制作用在以往研究中均有報(bào)道[13-14]。

利塞膦酸鈉作為第三代二磷酸鹽類藥物[15-17]，是目前一線應(yīng)用的抗股指數(shù)松藥物之一，但主要應(yīng)用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，對于失用性骨質(zhì)疏松的干預(yù)效果報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，利塞膦酸鈉可以部分阻止該模型松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨量丟失，較之辛伐他汀，對于維持皮質(zhì)骨厚度的作用更為顯著。但生物力學(xué)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兩者單獨(dú)干預(yù)均未能表現(xiàn)出顯著效果，利塞膦酸鈉對該模型小鼠組織學(xué)水平的影響并無顯著優(yōu)勢。有研究比較了聯(lián)合阿侖膦酸鹽和辛伐他汀或單獨(dú)用藥對高脂飲食卵巢切除大鼠的抗骨質(zhì)疏松和抗動脈粥樣硬化作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿侖膦酸鈉和辛伐他汀聯(lián)合應(yīng)用具有抗骨質(zhì)疏松、抗血脂異常和抗動脈粥樣硬化的作用[18]。本研究中，與單獨(dú)用藥相比，多項(xiàng)檢測均支持兩者聯(lián)合應(yīng)用效果更好，部分指標(biāo)包括微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)和彈性模量等與正常對照組無顯著差別，且均優(yōu)于單獨(dú)用藥組，OPG和RANKL蛋白水平的分析亦發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥促進(jìn)OPG表達(dá)的作用更顯著。在一項(xiàng)糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的大鼠骨質(zhì)疏松模型的研究中中，雖然利塞膦酸鈉表現(xiàn)出一定的保護(hù)骨質(zhì)量的作用，但合并辛伐他汀干預(yù)較單純利塞膦酸鈉表現(xiàn)出更好的效果[19]。

然而，不同性質(zhì)藥物合并使用并非能取得疊加或協(xié)同效應(yīng)，比如與單獨(dú)使用利塞膦酸鈉相比，維生素K2與利塞膦酸鈉合并使用并不能顯著降低骨質(zhì)疏松患者骨折發(fā)生風(fēng)險[20]。因此，本研究采用的干預(yù)方案對該類骨質(zhì)疏松的干預(yù)效果尚有待更多的研究證實(shí)和探討。此外，本研究存在一定的局限性。首先，兩種藥物選擇單一劑量，并未探討不同劑量配比的作用效果，不排除更佳藥物劑量的聯(lián)合應(yīng)用方案。此外，本研究并未探討聯(lián)合用藥方案對不同月齡大鼠模型的干預(yù)效果，且尾懸吊法不能完全模擬人類失用性骨質(zhì)疏松。因此，干預(yù)方案的單一和動物模型的選擇是本研究的主要局限，后續(xù)仍需更多研究深入探討。