管博文，盧延華，蘇路路，李程程，荊學(xué)雙，董銀萍，王月英，李德冠*，孟愛民*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室，天津 300192)

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，核電設(shè)施使用增多，人類太空活動能力提升使輻射暴露的可能性不斷增加。另外臨床接受放射性治療癌癥患者也在不斷上升。造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)對電離輻射(ionizing radiation，IR)具有高度的敏感性。受照后不僅會引起急性骨髓抑制，對遠(yuǎn)期造血免疫也會有影響。

受到亞致死劑量照射后會出現(xiàn)造血免疫系統(tǒng)急性損傷性變化。隨著時間延長機體各項免疫指標(biāo)逐步恢復(fù)，但也會出現(xiàn)一些持久性改變，從而影響機體的健康狀態(tài)，本文對在4 Gy、6 Gy亞致死劑量γ射線全身照射(total body irradiation，TBI)后6個月C57BL/6 J小鼠的各項免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測，為照射后造血免疫功能長期損傷研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10～12周齡SPF級雄性C57BL/6 J小鼠，體重22～24 g，共24只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物房屏障環(huán)境[SYXK(津)2014-0002]。本實驗經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所IACUC的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為1402，并根據(jù)3R原則對實驗動物的使用和飼養(yǎng)給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

熒光標(biāo)記抗體NK1.1-FITC購于Biolegend公司；CD11b-APC購于Invitrogen公司；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7購于BD公司；B220-percp-cy5.5、CD3-APC購于Biolegend公司；EDTA-K3購于Sigma公司；紅細(xì)胞裂解液購于Invitrogen公司；大鼠脾單個核細(xì)胞分離液試劑盒購于索萊寶公司；EasySepTMMouse T Cell Isolation Kit購于STEMCELL Technologies公司。全自動血液分析儀MEK-7222 K(日本光電)；BD流式分析儀(BD FACSAria II cell sorter，BD Bioscience)；銫源伽馬射線輻照儀(Gammacell-40，加拿大原子能有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與照射

小鼠隨機分為對照(control)組、4 Gy IR組和6 Gy IR組。照射組接受137Csγ射線一次性全身照射4 Gy或6 Gy，劑量率為1Gy/min。對照組接受假照射。

1.3.2 外周血細(xì)胞計數(shù)及分類

將小鼠稱重，0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg)。進(jìn)行內(nèi)眥靜脈取血，EDTA-K3抗凝，血細(xì)胞計數(shù)儀測定外周血計數(shù)及分類[1]。

1.3.3 免疫臟器系數(shù)

小鼠稱重后，分別取胸腺和脾并稱重，記錄下用于計算胸腺系數(shù)和脾系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器重量(mg)/小鼠體重(g)[2-3]。

1.3.4 外周血免疫細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞分型檢測

將分離的小鼠脾研磨制備脾細(xì)胞懸液。分別取外周血和脾細(xì)胞懸液50 μL，各加入1 mL 1×紅細(xì)胞裂解液，室溫條件下裂解8 min(期間混勻兩次)，1500 r/min離心5 min，4℃。棄去上清，每個樣品加入100 μL PBS重懸，分別加入對應(yīng)的混合抗體，冰上避光孵育30 min。2 mL PBS洗一遍，離心條件保持不變。加入300 μL PBS重懸并過濾至流式管，上機檢測[4]。

1.3.5 脾T細(xì)胞分離及p16 mRNA表達(dá)量檢測

按索萊寶ficoll試劑盒和STEMCELL Technologies的T細(xì)胞陰選試劑盒說明書方法進(jìn)行分離。將收集的細(xì)胞重懸計數(shù)，按每1× 106～5 × 106個細(xì)胞加入1 mL TRIzol保存，送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司檢測p16 mRNA表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血計數(shù)及分類

外周血計數(shù)結(jié)果如圖1，與對照組相比，受照后6個月小鼠白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白濃度均有一定程度的下降。其中4 Gy組與對照組相比，白細(xì)胞計數(shù)從8.62 ± 1.52下降到7.01 ± 0.8，下降了18.65%(P<0.001)。紅細(xì)胞計數(shù)從8.99 ± 0.36下降到8.56 ± 0.33，下降了4.70%(P<0.05)。血紅蛋白和血小板組差異沒有顯著性。

6 Gy照射6個月后，與對照組相比，白細(xì)胞計數(shù)從8.62 ± 1.52下降到5.94 ± 0.83，下降了31.00%(P<0.001)。紅細(xì)胞計數(shù)也從8.99 ± 0.36下降到8.33±0.26，下降了7.27%(P<0.001)。血紅蛋白濃度，6 Gy組比對照組從123.13 ± 5.51下降到113.75 ± 2.71，下降了7.55%(P<0.001)。血小板計數(shù)6 Gy組和對照組相比未見顯著性差異?？梢钥闯鲅“逵嫈?shù)基本以恢復(fù)到正常水平，見圖1A～1D。

4 Gy與6 Gy兩組間比較發(fā)現(xiàn)，只有血紅蛋白濃度這項指標(biāo)在4 Gy和6 Gy之間有明顯降低，呈極顯著性差異(P<0.01)，相差5.04%。外周血計數(shù)各項指標(biāo)均無計量依賴性，各項指標(biāo)均恢復(fù)到正常范圍。

中性粒細(xì)胞百分比，4 Gy和6 Gy組相較于對照組有明顯上升，分別從(8.3 ± 1.09)%上升到(15.46 ± 1.94)%(P<0.001)和(16.87 ± 6.89)%(P<0.05)。淋巴細(xì)胞百分比從(90.95 ± 1.9)%下降到(85.29 ± 3.19)%(P<0.01)和(82.75 ± 7.06)%(P<0.05)，分別具有極顯著性和顯著性。見圖1E～1F。

外周血白細(xì)胞計數(shù)及分類結(jié)果顯示，亞致死劑量全身照射后6個月，外周血計數(shù)及分類已經(jīng)恢復(fù)正常。但是白細(xì)胞、紅細(xì)胞計數(shù)仍然明顯低于對照組。白細(xì)胞降低有照射劑量依賴的趨勢。外周血細(xì)胞分類結(jié)果顯示照射組小鼠中性粒細(xì)胞比例升高、淋巴細(xì)胞比例下降，呈現(xiàn)細(xì)胞分化偏移現(xiàn)象，未見明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

注：A：白細(xì)胞計數(shù)；B：紅細(xì)胞計數(shù)；C：血紅蛋白濃度；D：血小板計數(shù)；E：中性粒細(xì)胞百分比；F：淋巴細(xì)胞百分比。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 免疫臟器系數(shù)

與對照組小鼠相比，4 Gy組和6 Gy組小鼠胸腺系數(shù)降低，其中6 Gy組與對照組差異有顯著性(P<0.05)；脾系數(shù)略有增加，差異無顯著性，結(jié)果見圖2。

注：A：胸腺系數(shù)；B：脾系數(shù)。*P<0.05。

2.3 外周血免疫分型

外周血采用流式分析法進(jìn)行分型測定。檢測輔助T細(xì)胞(CD4)、細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8a)、B淋巴細(xì)胞(B220)、自然殺傷細(xì)胞(NK1.1)，單核細(xì)胞采用F4/80和CD11b共標(biāo)。其中輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞是從單個核細(xì)胞亞群去分析，NK細(xì)胞和單核細(xì)胞是從白細(xì)胞群去分析。如圖3所示。

結(jié)果顯示，相對于對照組，4 Gy組和6 Gy組CD4+均有上升，從(12.49±1.16)%分別上升到(14.6±0.51)%和(16.48±2)%，差異均具有顯著性(P<0.05)。CD8a+細(xì)胞三個組別之間未見明顯變化。CD4/CD8比值分別為對照組1.16±0.10，4 Gy照射組1.28±0.17，6 Gy照射組1.46±0.26，6 Gy組CD4/CD8比值與對照組比較有明顯上升(P<0.05)。B220+細(xì)胞從對照組(62.89±2.33)%降低到4 Gy照射組(55.63±3.61)%和6 Gy照射組(54.2±3.54)%，差異均具有極顯著性(P<0.001)。NK1.1+細(xì)胞與B220+細(xì)胞變化趨勢一樣，從(8.44±0.7)%分別降低到(6.81±1.58)%和(6.6±0.65)%。上述三組4 Gy和6 Gy之間差異均無顯著性區(qū)別。單核細(xì)胞三個組別之間未見到明顯差異。結(jié)果見圖4。

注：A：CD4+；B：CD8+；C：B220+；D：NK1.1+；E：CD11b+F4/80+；F：CD4+/CD8+。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

外周血細(xì)胞免疫分型結(jié)果顯示，4 Gy、6 Gy照射后，B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞仍然低于對照組，提示受照后6個月未完全恢復(fù)。受照組CD4比例高于對照組。CD8單核細(xì)胞與對照組未見差異。

2.4 脾免疫細(xì)胞分型

采用流式細(xì)胞術(shù)分析脾中T細(xì)胞(CD3)和B淋巴細(xì)胞(B220)在脾單個核細(xì)胞分群中的占比變化。如圖5所示。

圖5 流式分析脾免疫細(xì)胞門的設(shè)置及示意圖

結(jié)果顯示，相較于對照組，照射組CD3+細(xì)胞有上升的趨勢，但無顯著性差異。B220細(xì)胞，照射組均有明顯下降，4 Gy組和6 Gy組相較于對照組有極顯著差異(P<0.01)，兩組之間未見明顯差異。見圖6。

注：A：CD3+；B：B220+。**P<0.01。

2.5 脾T細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)量檢測

為了進(jìn)一步研究照射對小鼠免疫細(xì)胞的遠(yuǎn)期影響，分離小鼠脾T細(xì)胞，用RT-PCR檢測照射后6個月脾T細(xì)胞中p16 mRNA表達(dá)，檢測結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)曲線公式以2-ΔΔCt進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，與對照組相比，6 Gy組有個別數(shù)據(jù)p16 mRNA明顯升高，采用卡方檢驗，未見顯著性差異。結(jié)果見圖7。

圖7 受照組小鼠與對照組小鼠脾T細(xì)胞的p16 mRNA表達(dá)比較

3 討論

本研究檢測亞致死劑量電離輻射全身照射對小鼠造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成的遠(yuǎn)期損傷。與對照組比較，結(jié)果顯示小鼠受到4 Gy或6 Gy全身照射6個月后，外周血白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白濃度仍低于對照組。而照射組小鼠中性粒細(xì)胞比例升高，淋巴細(xì)胞的比例降低。提示受到照射后，與對照組比較外周血白細(xì)胞仍然處于較低水平，可能導(dǎo)致機體抵抗力下降。外周血分類比例改變，提示出現(xiàn)了分化偏移現(xiàn)象。但是除了血紅蛋白外，6 Gy組與4 Gy組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。說明在經(jīng)過長時間恢復(fù)后，外周血和免疫細(xì)胞比例已經(jīng)基本恢復(fù)。

小鼠胸腺對電離輻射十分敏感，在接受照射6個月后，胸腺系數(shù)依舊未恢復(fù)至對正常水平。另一免疫器官，脾系數(shù)雖和對照組無顯著差別，外周血免疫分型中，照射組小鼠CD4+細(xì)胞占單個核細(xì)胞亞群的百分比上升，B淋巴細(xì)胞下降，自然殺傷細(xì)胞在白細(xì)胞群中的百分比明顯下降。提示照射引起天然免疫和適應(yīng)性免疫功能下降。淋巴細(xì)胞比例下降，以B淋巴下降為主；天然免疫功能下降以NK細(xì)胞下降為主。脾免疫分型中，B淋巴細(xì)胞在脾單個核細(xì)胞百分比降低。在脾T細(xì)胞中，6 Gy照射6個月后p16 mRNA表達(dá)量高于對照組，但無顯著性差異。

課題組對輻射引起的造血系統(tǒng)免疫損傷進(jìn)行了系統(tǒng)研究。小鼠外周血計數(shù)結(jié)果顯示，受照后大部分指標(biāo)恢復(fù)正常，但是白細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白濃度依然低于對照組。路璐等研究結(jié)果顯示，6 Gy照射2個月內(nèi)，白細(xì)胞和血小板下降程度明顯，紅細(xì)胞和血紅蛋白下降較為平緩[5]。兩個月內(nèi)恢復(fù)的趨勢也與本研究結(jié)果一致。造成這種現(xiàn)象的原因可能是造血系統(tǒng)對輻射損傷敏感，亞致死劑量的電力輻射造成了造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)損傷和衰老，影響其造血免疫功能，最后導(dǎo)致了度過了照射后初期白細(xì)胞血小板快速下降，以及中期紅細(xì)胞和血紅蛋白的下降后，遠(yuǎn)期(照射后6個月)外周血計數(shù)雖在緩慢恢復(fù)，但依然低于對照組。隨著小鼠受照后時間的延長，造血干細(xì)胞的衰老和損傷會導(dǎo)致其分裂分化能力降低，進(jìn)一步導(dǎo)致其數(shù)量減少，最終出現(xiàn)長期骨髓抑制等情況[6]。外周血細(xì)胞分類結(jié)果顯示照射組小鼠中性粒細(xì)胞比例升高、淋巴細(xì)胞比例下降，呈現(xiàn)細(xì)胞分化偏移現(xiàn)象，沒有明顯劑量反應(yīng)關(guān)系。與老年小鼠外周血計數(shù)結(jié)果一致，暗示著照射導(dǎo)致的骨髓細(xì)胞出現(xiàn)了病理性的衰老改變[7]。在老年機體中，HSC不能保持細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)，并趨向于向髓系細(xì)胞進(jìn)行分化，使得幼稚淋巴細(xì)胞數(shù)量下降。最終導(dǎo)致免疫功能整體下降。發(fā)生髓系分化偏移除了會造成免疫功能的下降，還會使髓系白血病發(fā)生的危險性升高。在急性髓系白血病中，主要是由白血病前體干細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的。而白血病前體干細(xì)胞傾向分化為髓系細(xì)胞[8]。亞致死劑量受照小鼠遠(yuǎn)期仍然表現(xiàn)出髓系偏移的變化，與老年小鼠一致。

照射組小鼠的胸腺系數(shù)出現(xiàn)明顯下降，胸腺對電離輻射損傷敏感，在6個月后依舊沒有恢復(fù)到正常水平。受照組小鼠脾系數(shù)有少許上升，但與對照組相比，無顯著性差異。李德冠等[9-10]的研究顯示，照射組小鼠受4 Gy和6 Gy照射10周后胸腺系數(shù)脾系數(shù)分別出現(xiàn)上升或下降的改變，但均無顯著性差異，且不呈劑量依賴性。胸腺受損會導(dǎo)致T細(xì)胞在發(fā)育過程中出現(xiàn)問題，減少幼稚T細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而影響細(xì)胞免疫效果。

外周血分型與李德冠等人[11]的研究比較發(fā)現(xiàn)在6 Gy照射后10 d時，小鼠處于輻射損傷急性期，外周血CD4、CD8、B220分別從(19.7 ± 4.7)%、(18.5 ± 1.7)%和(52.0 ± 6.6)%降到(15.5 ± 2.0)%、(5.1 ± 2.9)%和(7.9 ± 4.1)%。在10周時，4 Gy組和6 Gy組CD4從(12.1 ± 0.9)%分別上升到(18.7 ± 0.4)%和(21.9 ± 7.4)%，CD8由(11.7 ± 0.8)%分別上升至(17.2 ± 2.1)%和下降到(8.8 ± 0.6)%，B220則從(50.6 ± 6.5)%分別下降到(38.1 ± 2.9)%和(23.7 ± 12.2)%[9-10]。變化趨勢與本研究照射后6個月時的外周血免疫分型結(jié)果接近。本實驗中，CD4%的上升是源于在單個核細(xì)胞群中，CD4陽性細(xì)胞隨時間的恢復(fù)，且B220陽性細(xì)胞死亡比例較高恢復(fù)較慢導(dǎo)致的，屬于相對升高。崔玉芳等人[12]在研究中認(rèn)為小鼠受照后免疫方面有兩個特點：①短期內(nèi)損傷嚴(yán)重，②后期階段機體恢復(fù)速度緩慢。其中特別的是，在受到照射后6～12月，淋巴細(xì)胞仍處于恢復(fù)階段時，外周血淋巴細(xì)胞的凋亡率仍高出正常水平。CD3和CD8陽性T細(xì)胞仍未恢復(fù)到對照的水平[12]。本實驗中，先天免疫主要以NK細(xì)胞的減少為主，單核細(xì)胞照射組與對照組之間基本無差別，淋巴細(xì)胞中B細(xì)胞依舊處于緩慢恢復(fù)階段，T細(xì)胞則恢復(fù)明顯。與吳安慶等人[13]的研究中提出的淋巴細(xì)胞比單核細(xì)胞輻射敏感性強，淋巴細(xì)胞中B細(xì)胞也比T細(xì)胞對輻射更加敏感的結(jié)論相一致。6 Gy組CD4%/CD8%與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，但比值的上升主要是因為CD4%的相對上升，與免疫系統(tǒng)亢進(jìn)不一樣。

之后進(jìn)行脾免疫細(xì)胞分型中發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞在單個核細(xì)胞中的比例有明顯下降，并具有極顯著差異(P<0.01)。說明雖然在脾系數(shù)上與對照組沒有區(qū)別，但是功能上還沒有恢復(fù)至對照組水平。B淋巴細(xì)胞比例的下降可能會導(dǎo)致獲得性免疫中體液免疫水平的降低。進(jìn)一步造成抗體數(shù)量的減少和免疫記憶的減弱，無法及時在抗原入侵機體時有效的啟動免疫應(yīng)答。

p16基因是一種直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的細(xì)胞周期基因，同是也是一個抑癌基因。在受到一些細(xì)胞因子或是DNA損傷刺激下，會激活p38MAPK級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活p16-Rb通路，造成細(xì)胞的衰老，是常用的衰老標(biāo)志物[14]。我們前期研究結(jié)果顯示，亞致死劑量全身照射可以引起造血干細(xì)胞衰老，表現(xiàn)為p16升高，自我更新能力下降[15-16]。臨床研究顯示細(xì)胞毒性化療藥物及骨髓移植患者T細(xì)胞中p16表達(dá)水平明顯升高[17]。本研究中，6 Gy組結(jié)果顯示在8個有效數(shù)據(jù)中，有2例明顯升高，但無顯著性差異。T細(xì)胞p16 mRNA是否可以作為受照后引起的衰老生物學(xué)標(biāo)志有待進(jìn)一步研究認(rèn)證。

本項研究對中高劑量照射對小鼠造血免疫遠(yuǎn)期損傷初步分析結(jié)果顯示，受照組小鼠在經(jīng)過6個月的恢復(fù)后，免疫系統(tǒng)基本重建完畢，趨于穩(wěn)定。但髓系淋系分化偏移，B淋巴細(xì)胞比例下降等仍持續(xù)存在。這與造血免疫系統(tǒng)老齡化改變相似。討論中比較了照射后不同時間點造血免疫損傷程度及恢復(fù)情況，也與老年小鼠進(jìn)行了比較。這些初步探討進(jìn)一步驗證了亞致死劑量照射引起了小鼠造血免疫系統(tǒng)衰老性改變，為治療改善遠(yuǎn)期輻射損傷提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為受照小鼠用于造血免疫系統(tǒng)老年性改變機制研究提供支持。