陶 濤，汪國文，李其才，黎傳奎

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233004)

人參在我國具有悠久的使用歷史，在抗腫瘤中也具有一定的功效，人參皂苷Rg3(GS-Rg3)是一種從中藥人參中提取的固醇類中藥單體，具有多種生物學(xué)活性，包括對于腫瘤，GS-Rg3具有抑制其增殖、促進細胞凋亡的作用，但是關(guān)于其具體機制尚不明確[1]。最近有研究顯示GS-Rg3也具有抑制淋巴管生成的作用，腫瘤細胞通過淋巴管進入淋巴結(jié)是肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的主要方式之一，有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在腫瘤中過表達，發(fā)揮促增殖的作用，TGF-β1/ERK可以促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達從而促進管生成[2-3]。SCH772984是一種新型特異性的ERK抑制劑，廣泛應(yīng)用于ERK相關(guān)信號通路的研究。因此本文主要分析人參皂苷GS-Rg3對荷瘤人肺癌裸鼠淋巴管生成的機制，并研究其對腫瘤組織TGF-β1/ERK通路以及VEGF表達的影響，分析GS-Rg3的作用機制，為GS-Rg3在臨床治療肺癌提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

4～5周齡(體重14 g～17 g)的SPF級BALB/c無胸腺雄性裸鼠60只，均購自華東師范大學(xué)科學(xué)實驗動物中心閔行校區(qū)[SCXK (滬)2016-0004]，飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)科學(xué)實驗動物中心閔行校區(qū)[SYXK (滬)2015-0011]的獨立通風(fēng)籠盒中。

1.1.2 細胞系

人肺癌A549細胞購自ATCC(美國)。

1.2 主要試劑與儀器

RPM1-1640培養(yǎng)基以及胎牛血清等培養(yǎng)試劑購自Gibco(美國)；戊巴比妥購自Sigma公司(美國)；GS-Rg3購自齊一生物科技公司(中國，上海)；ERK抑制劑SCH772984購自Sellect公司；HE染色試劑盒購自武漢華美公司(中國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒購自TaKaRa(日本)；抗體TGF-β1、ERK、p-ERK、podoplanin、VEGF-C、VEGF-3以及相關(guān)二抗均來自Abcam公司(美國)；PVDF膜(Bio-Rad，美國)；PCR引物由Genewiz(中國)設(shè)計和合成。顯微鏡Nikon(日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 荷瘤裸鼠分組、建模及干預(yù)方法

將60只小鼠隨機分為3組，各20只，即模型組、GS-Rg3組和ERK抑制劑SCH772984組(以下簡寫為SCH772984組)。根據(jù)文獻[4]建立人肺癌裸鼠原位移植模型，將生長良好的A549細胞分裂并在新鮮培養(yǎng)基中再生長一天，皮下注射全部小鼠，注射細胞數(shù)為5×106個，待瘤體生長至10 mm使剝離瘤體移植至模型組、GS-Rg3組和SCH772984組的小鼠肺組織。GS-Rg3組小鼠在移植后第3天使用GS-Rg3灌胃，每只0.8 mg/kg，SCH772984組小鼠移植后第3天腹腔注射SCH772984，每只12.5 mg/kg，每3 d一次，飼養(yǎng)28 d后處死小鼠進行檢驗。實驗過程遵循3R原則，并通過蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實驗動物使用與管理委員會批準(zhǔn)(H 2017123546)。

1.3.2 腫瘤生長情況以及病理學(xué)檢查

戊巴比妥腹腔注射(60 mg/kg)麻醉后處死大鼠，打開胸腔，觀察肺癌生長和轉(zhuǎn)移情況，并取出肺組織，測量腫瘤體積，使用HE染色檢測肺組部組織學(xué)變化，按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 免疫組化染色

肺癌原位移植瘤組織用甲醛和石蠟固定，將切片(4.0 μm)脫石蠟并再水合，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，首先封閉切片并在4℃下用VEGF-C、VEGF-3或podoplanin抗體孵育過夜，然后在室溫下與生物素化的抗小鼠IgG孵育30 min，隨后染色，顯微鏡觀察，根據(jù)文獻報道的方法[5]計算淋巴管密度。

1.3.4 qPCR

qPCR用于檢測肺癌原位移植瘤組織中mRNA水平，組織裂解后收集總mRNA，通過95℃激活DNA聚合酶5 min進行PCR，然后進行40個循環(huán)的兩步PCR(95℃，10 s和60℃，30 s)，最終75℃延伸10 min，保持在4℃，GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

1.3.5 Western blot

使用Western blot檢測肺癌原位移植瘤組織中蛋白水平。在液氮的保護下裂解組織，在12 000 r/min，4℃離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白質(zhì)濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 建模及干預(yù)情況

模型組和各干預(yù)組小鼠肺癌模型均建立成功，并通過HE染色病理檢查證實肺癌以及肺癌淋巴轉(zhuǎn)移，見圖1。干預(yù)后21 d模型組小鼠死亡1只，其余小鼠無死亡。GS-Rg3組和SCH772984組小鼠出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的比例、腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均顯著低于模型組，GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，見表1。

2.2 各組淋巴微管著色情況比較

本次研究使用podoplanin蛋白標(biāo)記淋巴管，圖2中褐色為podoplanin染色，可用于反映淋巴管生長情況。結(jié)果顯示GS-Rg3組和SCH772984組podoplanin蛋白表達水平和淋巴管相對密度顯著低于模型組，而GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，其免疫組化染色結(jié)果見圖2、表2。

注：箭頭指示淋巴轉(zhuǎn)移。標(biāo)尺=100 μm。

Table1Comparison of lymphatic metastases and lung tumor volumes of the mice in each group

組別Groupsn淋巴轉(zhuǎn)移個數(shù)及百分比Number and percentage of lymphatic metastases腫瘤體積(mm3)Tumor volume腫瘤質(zhì)量(g)Tumor mass模型組Model group1915(78.95%)583.43±18.540.72±0.21GS-Rg3組GS-Rg3 group207(35.00%)??302.93±17.51??0.29±0.17??SCH772984組SCH772984 group205(25.00%)??231.45±14.25??0.21±0.14??

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

表2 各組小鼠podoplanin蛋白表達水平

注：與模型組比較，*P<0.05。

Note.Compared with the model group,*P<0.05.

2.3 各組TGF-β1/ERK通路表達水平比較

GS-Rg3組和SCH772984組可以顯著抑制TGF-β1和ERK mRNA的表達，并且GS-Rg3組和SCH772984組的p-ERK/ERK水平顯著低于模型組，而GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，說明GS-Rg3可抑制TGF-β1/ERK通路的激活，見表3和圖3。

2.4 各組腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-3表達水平比較

免疫組化檢測結(jié)果顯示GS-Rg3和SCH772984的VEGF-C、VEGF-3表達水平較模型組低，而GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，見圖4、圖5和表4。

表3 各組小鼠TGF-β1、ERK mRNA和蛋白表達水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

圖3 Western blot檢測各組小鼠中TGF-β1、p-ERK和ERK蛋白水平

3 討論

肺癌的發(fā)病率及病死率均高居首位，調(diào)查顯示2015年我國肺癌新發(fā)病例數(shù)達到73.3萬，死亡病例高達61萬，并且其發(fā)病率和死亡率仍呈現(xiàn)上升趨勢[6]。雖然隨著新的激酶抑制劑藥物、放療新方法被不斷應(yīng)用于臨床，肺癌患者的短期療效有了顯著的提升，但是肺癌的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移情況仍未得到顯著的改善，并且對于化療藥物的耐藥問題仍未得到有效的解決[6]。

中藥在治療腫瘤中取得了一定的進展，可能成為治療肺癌的新方法。人參在中國具有悠久的使用歷史，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)人參也具有較好的抗腫瘤作用，人參可以抑制胃癌細胞的生長并促進其凋亡[7]。分析人參中的抗腫瘤活性成分并探究其抗腫瘤機制是研究的熱點，也是將中藥在臨床上大范圍推廣的重要手段，GS-Rg3是人參的主要活性成分之一，可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，但是關(guān)于其對肺癌作用的相關(guān)機制的研究還不足[8-9]。血管以及淋巴管的形成是腫瘤向遠端轉(zhuǎn)移的主要途徑，目前關(guān)于GS-Rg3在腫瘤管生成中的研究不多，最近的也有研究顯示GS-Rg3也具有抑制血管生成的作用[10]，關(guān)于GS-Rg3對腫瘤淋巴管形成的影響研究極少。肺癌細胞進入淋巴管是肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的主要途徑，淋巴轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差，為研究GS-Rg3對淋巴管生成的影響，我們建立了人肺癌裸鼠原位移植模型，并分別使用GS-Rg3干預(yù)，通過HE染色監(jiān)測腫瘤建模情況和淋巴轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示模型組淋巴轉(zhuǎn)移率為78.95%，而GS-Rg3可顯著抑制淋巴轉(zhuǎn)移情況，并且GS-Rg3也顯著抑制腫瘤的質(zhì)量和體積。為進一步分析GS-Rg3對淋巴管生成的影響，我們使用podoplanin蛋白標(biāo)記淋巴管，結(jié)果顯示模型組淋巴管較為豐富，而GS-Rg3可抑制podoplanin蛋白表達水平，減少淋巴管生成。國內(nèi)已有臨床研究顯示GS-Rg3在治療中晚期肺癌中的作用[11]，并且也有動物體內(nèi)實驗證實通過納米材料遞送GS-Rg3可以抑制小鼠肺癌模型的生長[12]。國外也有研究顯示，GS-Rg3在異種移植小鼠模型中可以降低腫瘤體積和重量，并通過尾靜脈注射顯著降低肺組織中的腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，GS-Rg3可通過下調(diào)FUT4介導(dǎo)的EGFR失活和阻斷MAPK和NF-κB信號通路來抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和肺癌的侵襲，研究還認(rèn)為GS-Rg3可能是治療肺癌的潛在有效藥物[13]。此外，Rg3在異種移植小鼠模型中降低腫瘤體積和重量，并通過尾靜脈注射顯著降低肺組織中的腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。戴曉軍等[14]研究也發(fā)現(xiàn)了GS-Rg3對淋巴管生成中的抑制作用。這說明GS-Rg3可以通過抑制肺癌組織中淋巴管的生成抑制淋巴轉(zhuǎn)移。這說明了GS-Rg3可以抑制肺癌的生長以及荷瘤裸鼠腫瘤組織中的淋巴管的生成，從而減少了肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移。為進一步分析GS-Rg3抑制淋巴管生成的機制，使用ERK抑制劑SCH772984作為陽性對照，分析其對TGF-β1/ERK信號通路和VEGF的表達水平的影響。TGF-β1/ERK信號通路在肺癌組織中過表達，并可通過調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡以及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等相關(guān)蛋白促進肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡，而抑制TGF-β1/ERK信號通路可有效的抑制腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡，并且具有抑制腫瘤組織血管生成、淋巴管生成的作用[15]。VEGF可以高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長，不但可以促進腫瘤組織血管生長，還具有促進遷移侵襲的作用，此外，VEGF也具有促進淋巴管內(nèi)皮細胞生長的作用，幾乎在所有的腫瘤組織中VEGF的表達水平均上調(diào)。上調(diào)VEGF的表達可促進血管和淋巴管的生長從而為腫瘤生長提供養(yǎng)分養(yǎng)料以及促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，并且抑制VEGF的表達也是有效減少腫瘤生長和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法[16]。本次研究結(jié)果顯示SCH772984可以抑制肺癌原位移植瘤組織中的淋巴管生成，并且GS-Rg3和SCH772984可以顯著抑制TGF-β1和ERK mRNA的表達，并且GS-Rg3和SCH772984可以顯著抑制ERK磷酸化，抑制TGF-β1/ERK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，并抑制VEGF-C、VEGF-3蛋白的表達。TGF-β1/ERK信號通路被激活后會促進多種腫瘤相關(guān)蛋白的表達，抑制TGFβ信號通路抑制VEGF的表達，從而減少腫瘤細胞浸潤[17]。Liu等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)抑制ERK通路也具有抑制VEGF表達的作用，從而抑制胰腺癌的血管生成。也有研究顯示VEGF等蛋白的過表達也可以激活ERK等相關(guān)通路促進腫瘤細胞的遷移和侵襲引起腫瘤的轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移[19]。Tang等[20]的研究顯示GS-Rg3可通過抑制TGF-β/Smad和ERK信號通路在體外抑制瘢痕成纖維細胞增殖以及血管生成，說明GS-Rg3具有抑制制TGF-β以及ERK信號通路的作用。Cao等[21]的研究發(fā)現(xiàn)GS-Rg3可以抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠VEGF的表達。國內(nèi)也有研究顯示在原代喉鱗癌細胞以及人喉鱗癌裸鼠移植瘤中，GS-Rg3可以抑制TGF-β、VEGF-C蛋白的表達[22-23]。這提示在人肺癌裸鼠原位移植中，GS-Rg3可能通過抑制TGF-β1/ERK信號通路調(diào)節(jié)VEGF的水平，從而抑制腫瘤組織中淋巴管的生成，從而減少腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。

注：箭頭所示褐色為VEGF-C陽性染色。標(biāo)尺=20 μm。

注：箭頭所示褐色為VEGF-3陽性染色。標(biāo)尺=20 μm。

表4 各組小鼠腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-3表達水平

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

綜上所述，GS-Rg3可以通過下調(diào)TGF-β1/ERK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平抑制VEGF-C、VEGF-3蛋白的表達，從而抑制淋巴管的生成降低肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移率，這提示GS-Rg3對于晚期或淋巴轉(zhuǎn)移肺癌的治療作用。但是關(guān)于GS-Rg3抑制淋巴管生成的機制和臨床效果還需要進一步研究。