田苗苗，田祖宏，張慧霞，張 瑩，寧思明，聶勇戰(zhàn)，胡思雋

(第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院/空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤生物學國家重點實驗室，西安 710032)

胃癌是世界第四大腫瘤，全球胃癌致死率位居所有腫瘤第二位，是我國死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，對人類健康具有很大的威脅[1]。盡管針對胃癌的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)取得了諸多進展，但是由于胃癌患者的早診率低和多重耐藥等限制，預后仍然較差[2]。胃癌主要治療措施包括手術(shù)治療及化療。胃癌化療治療方案中，一類重要的靶點是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)。

RTKs是一個跨膜激酶蛋白家族，可以通過和配體結(jié)合及磷酸化等模式激活下游信號通路進而激活一系列生化反應，參與多種生命活動，包括組織修復和凋亡清除、免疫調(diào)控等[3-4]。Axl(Anexelekto)是RTKs的一種，其在不同類型癌癥中均有較高表達，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移，并且與癌癥的不良預后相關[5-9]。Axl可介導肺癌、乳腺癌、頭頸和食管鱗狀上皮細胞癌等腫瘤的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移及耐藥等[10-12]。Axl信號通路在胃癌組織和細胞系中高表達，可能通過Akt信號通路調(diào)控胃癌細胞增殖，然而具體調(diào)控機制仍不明確[13]。為了進一步探討Axl與胃癌發(fā)生發(fā)展之間的關系，本研究著眼于Axl表達量與胃癌之間的關系及Axl高表達對對裸鼠胃癌系皮下成瘤的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性BALB/c裸鼠(5 ～ 6周齡，約20 g)購自北京維通利華有限公司[SCXK (京)2016-0011]；飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心[SYXK (陜)2014-001]，12 h晝夜交替，溫度保持在23℃ ～ 25℃，相對濕度恒定在40% ～ 60%，自由飲食。實驗分為兩組，每組8只。實驗動物設計符合福利倫理要求，實驗動物福利倫理審批號：20190214，本實驗符合動物實驗的3R原則。

1.1.2 組織樣本

收集第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院(空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院)2008年至2010年間經(jīng)病理檢查的胃癌和癌旁組織101例，交由上海芯超生物科技有限公司制備為胃癌和癌旁芯片。實驗所用組織均經(jīng)病人本人和家屬同意，并簽署知情同意書，且經(jīng)過醫(yī)學倫理委員會審批，倫理委員會批件號：KY20192088-F-1。

1.1.3 細胞系

人胃癌細胞SGC-7901細胞購自上海吉凱生物公司。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購自四季青公司；1640培養(yǎng)基和胰酶購自美國Gibco公司；過表達慢病毒購自上海吉凱生物公司；抗Axl抗體購自美國CST公司；免疫組化用山羊抗兔IgG和DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。激光共聚焦掃描顯微鏡(FLUOVIEW FV10I)購自美國Olympus公司；小動物活體成像儀(Lumina2)購自美國PE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高表達Axl細胞的構(gòu)建

SGC-7901細胞以2×106個/孔密度鋪于六孔板中，過夜貼壁后加入適量具有綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因的慢病毒(過表達慢病毒Let-Axl或?qū)φ章《綥et-Null)，共培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基。72 h后加入嘌呤霉素篩選已轉(zhuǎn)染細胞，熒光顯微鏡觀察同時進行Western blot和定量PCR檢測確定轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功可進行細胞傳代和后續(xù)研究。

1.3.2 裸鼠皮下成瘤及小動物活體成像

BALB/c裸鼠(6周)16只用于成瘤實驗，將胃癌細胞SGC-7901/Let-Axl和SGC-7901/Let-Null消化后，PBS清洗兩次，去除殘留培養(yǎng)基，將1×106個細胞接種于裸鼠的右側(cè)背部皮下，每周觀察裸鼠的狀態(tài)、腫瘤的生長狀況[14]。于第二和四周時，對裸鼠進行麻醉后，利用小動物活體成像儀進行荷瘤裸鼠活體成像并拍照(生物發(fā)光，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長507 nm)[15]。

1.3.3 定量PCR

采用總RNA提取試劑盒對細胞總RNA進行提取，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，定量PCR試劑盒進行定量。內(nèi)參為GAPDH，引物序列GAPDH-F(5’→3’): GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；GAPDH-R(5’→3’): TGGTGAA-GACGCCAGTGGA；Axl引物序列為Axl-F(5’→3’): CCGGGTTCATCAACATC AA；Axl-R(5’→3’): CTGACATTCTCGAGATCGA。

1.3.4 Western blot檢測

用RIPA裂解液將細胞裂解并用細胞刮收集，測定總蛋白濃度后，每孔上樣40 μg蛋白，150 V恒壓電泳40 min，100 V恒壓轉(zhuǎn)PVDF膜1 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜后，相應二抗室溫孵育2 h，通過ECL試劑盒發(fā)光檢測。

1.3.5 免疫組化

組織切片于60℃烤箱烘烤2 h。常規(guī)脫蠟(依次為)：二甲苯、二甲苯、無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，其中二甲苯浸泡10 min，乙醇浸泡5 min?？乖迯停涸谇逅衅磧纱?，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中煮沸3 min(中火)，待高壓鍋中煮沸后將組織片置于其中高壓修復2 min，冷卻至室溫。滅活內(nèi)源性過氧化氫酶：在清水中沖洗一段時間，加入3% H2O2浸泡10 min。血清封閉：將載玻片置于PBS中5 min，清洗2次，山羊血清封室溫下封閉30 min。加一抗：加入Axl抗體(稀釋濃度1∶300)，以PBS作為作為陰性對照組，4℃孵育過夜。加二抗：PBS中洗3次，每次5 min，加二抗，然后置于37℃溫箱中30 min。顯色：PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加DAB顯色劑。鏡下觀察組織染色情況至合適深淺。將顯色后的片子用清水沖洗15 min后，浸泡于蘇木精中染色1 min。脫水：水中沖洗5 min后，依次將載玻片放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯。每個試劑中放置2 min，最后浸泡在二甲苯中，通風柜中用中性樹脂封片晾干。

1.3.6 表達分級判斷標準

免疫組化表達分級通過兩方面打分評判：(1)陰性為0；陽性占0%～33%的記作1；34%～66%的記作2；67%～100%的記作3。(2)染色強度：分別將未顯色、淺黃、棕黃和棕色記為0、1、2、3四個等級。將兩個評分相乘并分為0、1、2和3四個表達強度等級。

1.3.7 細胞免疫熒光染色

多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次后山羊血清封閉1 h。一抗4℃孵育過夜后，用相應熒光二抗室溫孵育2 h，DAPI室溫染色10 min，加入抗淬滅劑封片保存。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中Axl高表達

為了觀察胃癌組織中Axl的表達情況，我們收集了本院消化外科胃癌手術(shù)病人手術(shù)切除組織并制作胃癌組織芯片。經(jīng)過免疫組化染色，Axl在胃癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織(圖1)。101例免疫組化統(tǒng)計結(jié)果見表1。胃癌組織中，強度為中陽性(++)和強陽性(+++)分別有34例和7例，而在癌旁組織中，強度為中陽性(++)和強陽性(+++)分別只有5例和0例。胃癌組織中Axl表達量顯著高于癌旁組織(P<0.001)。

2.2 Axl高表達細胞構(gòu)建

為了深入研究Axl高表達與胃癌發(fā)生發(fā)展之間的關系，我們首先構(gòu)建了高表達Axl的SGC-7901細胞。經(jīng)過慢病毒Let-Axl的轉(zhuǎn)染，通過定量PCR技術(shù)檢測表明，SGC-7901/Let-Axl中Axl mRNA的含量顯著高于SGC-7901/Let-Null組(P<0.001，圖2 A)。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，SGC-7901/Let-Axl中Axl蛋白含量顯著高于SGC-7901/Let-Null(圖2B)。免疫熒光染色也表明SGC-7901/Let-Axl細胞中Axl含量明顯升高(圖2C)。

注：A：胃癌組織；B：癌旁組織。

表1胃癌組織與癌旁組織Axl蛋白表達水平

Table1Axl expression levels in gastric cancer tissues and adjacent tissues

組別Groups表達分級Rank-++++++nP胃癌組織Gastric cancer tissues3030347100癌旁組織Adjacent tissues692750101<0.001

注：A：定量PCR結(jié)果；B：Western blot檢測Axl表達量；C：免疫組化結(jié)果。**P<0.01，***P<0.001。比例尺為20 μm。

注：A：小動物活體成像結(jié)果；B：小動物活體成像熒光強度統(tǒng)計(皮下注射腫瘤細胞4周后)。**P<0.01。

2.3 小動物活體成像檢測Axl對胃癌腫瘤的影響

為了進一步研究Axl高表達對胃癌的影響，我們進行了裸鼠皮下胃癌細胞成瘤實驗。在分別注射Axl高表達細胞SGC-7901/Let-Axl及其對照細胞SGC-7901/Let-Null兩周后，通過小動物活體成像可以看出，高表達Axl的SGC-7901細胞所成皮下瘤熒光強度大于對照組，在注射腫瘤細胞4周后，再次進行小動物活體成像，結(jié)果顯示，SGC-7901/Let-Axl所成皮下瘤熒光強度顯著大于對照組(圖3A)。熒光強度分析結(jié)果顯示，注射SGC-7901/Let-Axl所形成腫瘤在小動物活體成像下熒光強度顯著高于SGC-7901/Let-Null(P<0.01，圖3B)。以上結(jié)果顯示，SGC-7901/Let-Axl成瘤能力顯著高于SGC-7901/Let-Null，Axl高表達可以增強胃癌細胞SGC-7901的皮下成瘤能力。

2.4 高表達Axl增強胃癌細胞皮下成瘤能力

裸鼠皮下接種胃癌細胞4周后，SGC-7901/Let-Axl所形成的腫瘤明顯大于SGC-7901/Let-Null組(圖4A、4B)。處死裸鼠后，取出皮下瘤，對其體積和重量進行測量。相對于對照組SGC-7901/Let-Null，高表達Axl細胞SGC-7901/Let-Axl所形成的皮下瘤的體積顯著增大(P<0.01，圖4C)，質(zhì)量也顯著增大(P<0.01，圖4D)。這些結(jié)果表明，Axl高表達能夠增強胃癌細胞皮下成瘤能力。

3 討論

胃癌是我國第二大惡性腫瘤，致死率亦位居第二[1]。盡管胃癌的診斷和治療技術(shù)有了很大改進，但胃癌患者的5年總生存率仍然不能令人滿意[2]。癌癥化療治療方案中，RTKs是一類極其重要的靶點。進一步深入研究RTKs與胃癌的關系，具有重要的臨床意義。

Axl是RTKs家族中重要的一員，在多種腫瘤中有過表達或異位表達，可以激活相關通路參與腫瘤的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移、凋亡抑制和耐藥性[16]。研究表明，急性白血病細胞可以誘導骨髓間質(zhì)細胞分泌Gas6，從而介導表達Axl的急性白血病細胞進行增殖、存活和耐藥性。在食管鱗狀細胞癌中，Axl高表達且與生存期呈負相關[17]。在胰腺癌中，Axl與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關，與生存期呈現(xiàn)負相關[18]。在肝癌中，Axl可以促進原發(fā)性肝癌的細胞增殖和侵襲能力[19]。

在本研究中，我們檢測了進行胃癌外科手術(shù)患者的胃癌及癌旁組織中的Axl的表達量，結(jié)果顯示，胃癌組織相比與癌旁組織，Axl表達量顯著升高，這提示Axl與胃癌的發(fā)生發(fā)展可能具有密切的關系。為了確定Axl參與胃癌發(fā)生發(fā)展，我們構(gòu)建Axl高表達胃癌細胞，在裸鼠體內(nèi)進行皮下成瘤，通過小動物活體成像檢測證實，Axl高表達能夠顯著提高胃癌細胞的皮下成瘤能力，處死動物后，取瘤組織測量體積和重量，確認了與活體成像結(jié)果的一致性。本研究一系列結(jié)果提示，Axl與胃癌的發(fā)生和發(fā)展可能具有密切的關系。

Axl已成為多種腫瘤的治療靶點和潛在的生物標志物，多種針對Axl的小分子抑制劑也已面市。我們通過本研究證實，Axl與胃癌的發(fā)生和發(fā)展可能具有密切的關系，可能可以作為胃癌預防、早診及治療的關鍵分子?；诒狙芯拷Y(jié)果，經(jīng)過后續(xù)深入研究探索，有望開發(fā)出以Axl為靶點治療胃癌的新型有效的抗腫瘤藥物和以Axl為胃癌標志物的診斷試劑盒。

注：A：裸鼠皮下瘤生長情況；B：Axl高表達及對照組所形成的皮下瘤；C：皮下瘤體積；D：皮下瘤質(zhì)量。**P<0.01。紅色圓圈所示為裸鼠皮下瘤。