王 瑩 ，楊海朝 ，薛 剛 ，劉鳳霞 ，張 俊 ，王巧玲，王詩萌，陳 玉

（1.南陽理工學(xué)院，河南南陽 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽 473004；3.河南順天生物科技有限公司，河南南陽 473300）

SOD最開始的提取原料來源是動(dòng)物血，但是該方法逐漸被淘汰了，一方面由于成本太高，另一方面因?yàn)榻陣鴥?nèi)外多種流行病的肆虐，很多國家為了避免人與動(dòng)物病毒交叉感染，都已禁止從國外進(jìn)口動(dòng)物SOD[1]?，F(xiàn)在SOD提取來源主要是從微生物、微生物發(fā)酵和植物中獲得，酵母菌、細(xì)菌、真菌、生物工程菌等微生物和植物的根莖、葉子、種子或其他瓜果都是提取SOD主要來源[2]。從植物中提取SOD是目前SOD提取研究的熱門，大多研究[3-9]是從大蒜、玉米、番茄、桑葉、沙棘、仙人掌等植物中提取SOD。主要利用SOD的物理化學(xué)特性，已建立的天然原料粗分離的方法有熱變性法、等電點(diǎn)法、氯仿-乙醇沉淀、丙酮分級(jí)沉淀法和硫酸鉛鹽析法等。神州草是一種產(chǎn)量高、生長能力頑強(qiáng)、適應(yīng)各種極端自然環(huán)境的天然綠色草本植物，其組成成分豐富，具有較高含量的SOD和蛋白質(zhì)等物質(zhì)[10]。試驗(yàn)以新鮮神州草為原料提取SOD，為企業(yè)綜合開發(fā)神州草資源及生產(chǎn)高活性SOD產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

神州草，南陽市乾景中藥材開發(fā)有限公司提供。

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氯化鈉、濃鹽酸、L-抗壞血酸（VC）、焦性沒食子酸、乙二胺四乙酸二鈉、無水乙醇、丙酮等試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；TGL-16C型高速離心機(jī)、TGL-16gR型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；BSA224SCW型電子天平，Sartorius（中國） 有限公司產(chǎn)品；FD-1C-80型真空冷凍干燥機(jī)，北京奧博康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；HFM-0530型中空纖維膜小試設(shè)備，廈門福美科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SOD酶活性的測定

選用鄰苯三酚自氧化法測定神州草SOD酶的活性[11]。

鄰苯三酚自氧化速率測定和酶抑制氧化速率測定加樣見表1。

表1 鄰苯三酚自氧化速率測定和酶抑制氧化速率測定加樣/mL

在測定鄰苯三酚的自氧化速率是必須把它的自氧化速率控制在0.07 A/min。

試管中加入4.5 mL pH值8.6濃度50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，置于25℃水浴中恒溫保存，20 min后迅速加入50 mmol/L鄰苯三酚溶液10 μL，迅速混勻后倒入石英比色杯中，于波長325 nm處測吸光度（對(duì)照管用pH值8.6，濃度50 mmol/L Tris-HCl緩沖液代替）。自加入鄰苯三酚開始計(jì)時(shí)，每隔30 s讀取1次吸光度，準(zhǔn)確記錄前3 min吸光度的變化，求出鄰苯三酚自氧化速率的平均值記為A0。測定SOD活性時(shí)，加入10 μL一定濃度的SOD酶液于25℃保溫20 min后，再加入10 μL鄰苯三酚，同上操作，算出加入SOD后鄰苯三酚自氧化速率的平均值記為A1。SOD產(chǎn)品酶活計(jì)算公式如下：

式中：A0——鄰苯三酚的自氧化吸光度；

A1——加入SOD后鄰苯三酚的自氧化吸光度。

1.2.2 神州草SOD的提取工藝

（1）神州草上清液的制備。①打漿。準(zhǔn)確稱取新鮮神州草1 kg，加入2.5 L預(yù)冷的pH值7.8浸提液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%聚乙二醇溶液250 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%Triton 80溶液125 mL分別作為保護(hù)劑和溶膜劑，攪拌均勻后用打漿機(jī)進(jìn)行打漿。②浸提。將打漿后的神州草漿液放入冰箱浸提1 h。③固液分離。利用紗布過濾除去較大的固形物神州草渣，經(jīng)低速大容量離心機(jī)離心得到神州草清液。

（2）SOD濃縮液的制備。①一次膜處理。用截留相對(duì)分子質(zhì)量為100 000以上的中空纖維膜膜組件超濾，待神州草的浸提液濃縮至200 mL左右時(shí)停止，上清液備用。濃縮液為神州草多糖和大分子量蛋白濃縮液（可作為提取多糖使用）。②二次膜處理。一次過膜透過液再通過截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000的中空纖維膜過濾至濃縮液200 mL左右時(shí)停止，此時(shí)的濃縮液為神州草SOD濃縮液，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（3）脫色和激活。準(zhǔn)確量取40 mL SOD濃縮液于100 mL的三角瓶，加入0.5 g的活性炭和0.5 g活性白土，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%氯化銅激活劑0.1 mL，置于120 r/min搖床脫色30 min。以轉(zhuǎn)速7 000 r/min離心，棄去沉淀，所得上清液預(yù)冷備用。

（4）有機(jī)溶劑去雜。預(yù)冷上清液加入上清液總體積30%的氯仿∶乙醇=3∶5混合溶劑，混勻靜置5 min，以轉(zhuǎn)速7 000 r/min冷凍離心6 min，吸取上相清液預(yù)冷備用。

（5）丙酮沉淀。預(yù)冷后的上清液中加入等體積預(yù)冷丙酮，混勻靜置2 h，以轉(zhuǎn)速7 000 r/min冷凍離心6 min，上清液用于回收丙酮。

（6）真空冷凍干燥。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥即為SOD產(chǎn)品，測定產(chǎn)品SOD酶活。

1.2.3 神州草SOD的提取條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

（1）浸提液種類的確定。按4種緩沖液進(jìn)行原料預(yù)處理：pH值7.8的0.9%氯化鈉、濃度50 mmol/L磷酸鹽、Tris-HCl和Tris-HAc浸提液預(yù)處理后，得到相應(yīng)的SOD濃縮液。

（2）激活劑用量的確定。將40 mL濃縮液置于100 mL三角瓶中，分別加入100，125，150，175，200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%氯化銅激活劑，其他步驟同1.2.2。測定產(chǎn)品SOD酶活，確定最佳激活劑用量。

（3）脫色時(shí)間的確定。將40 mL濃縮液置于100 mL三角瓶中，加入最佳激活劑，再加入0.5 g的活性炭和0.5 g活性白土，選擇10，15，20，25，30 min。其他步驟同1.2.2。測定產(chǎn)品SOD酶活，確定最佳脫色時(shí)間。

（4）乙醇-氯仿混合體系添加量的確定。40 mL濃縮液于100 mL三角瓶中，添加最適激活劑量，按最佳脫色時(shí)間處理，加入上清液總體積30%，40%，50%，60%，70%的氯仿∶乙醇=3∶5混合溶劑，離心得上清液。其他步驟同1.2.2。測定產(chǎn)品SOD酶活，確定最佳乙醇-氯仿混合體系添加量。

（5）丙酮用量的確定。最終的上清液分別加0.6，0.8，1.0，1.2，1.4倍體積預(yù)冷丙酮后提取SOD。測定產(chǎn)品SOD酶活，確定丙酮最佳用量。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提液的確定

采用pH值7.8的4種浸提液，提取神州草中的SOD產(chǎn)品后，測定其酶活。

不同提取液對(duì)SOD酶活性的影響見表2。

表2 不同提取液對(duì)SOD酶活性的影響（酶活性U/mg·pro）

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析可知，它們之間的差異達(dá)到了極顯著水平（F=17.695**，見表7）。氯化鈉提取液與Tris-HCl提取液差異不顯著（顯著性檢驗(yàn)表略），且氯化鈉浸提液比Tris-HCl提取液更經(jīng)濟(jì)節(jié)約，由于SOD在中性和弱堿性條件下穩(wěn)定。因此，不同植物浸提液的pH值不一樣，對(duì)于神州草選擇pH值7.8的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液為最佳提取液。

2.2 激活劑用量的確定

在SOD濃縮液中加入激活劑20%氯化銅100，125，150，175，200 μL進(jìn)行酶的提取，最后經(jīng)過測定得到酶的活性。

激活劑用量對(duì)SOD活性的影響見表3。

對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析知，它們之間的差異達(dá)到了極顯著水平（F=294.964**，見表7）。激活劑用量為125 μL與150 μL差異不顯著（顯著性檢驗(yàn)表略），激活劑用量過大時(shí)酶活力降低。說明微量金屬離子有激活作用，量大時(shí)是抑制作用。因此，不同的植物SOD含量不一樣，激活劑用量應(yīng)該是不同的。對(duì)于神州草最佳用量是125~150 μL/40 mL酶液。

表3 激活劑用量對(duì)SOD活性的影響（SOD 酶活性 U/mg·pro）

2.3 脫色時(shí)間的確定

加入濃縮液體積的1.25%的活性炭和1.25%活性白土進(jìn)行不同的脫色時(shí)間處理，測定SOD產(chǎn)品酶活。

不同脫色時(shí)間對(duì)SOD活性的影響見表4。

表4 不同脫色時(shí)間對(duì)SOD活性的影響（SOD 酶活性 U/mg·pro）

對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析知：它們之間的差異達(dá)到了極顯著水平（F=32.131**，見表7）。脫色時(shí)間20，25，30 min差異不顯著（顯著性檢驗(yàn)表略），不同的植物所含色素不一樣，脫色劑用量和脫色時(shí)間也不同。對(duì)于神州草加入濃縮液體積1.25%的活性炭和1.25%活性白土進(jìn)行20 min脫色為最好。

2.4 有機(jī)溶劑乙醇-氯仿混合劑添加量的確定

向SOD上清液中分別加入清液總體積30%，40%，50%，60%，70%的乙醇-氯仿的混合溶劑進(jìn)行去雜，測定SOD產(chǎn)品活性。

氯仿-乙醇混合溶劑添加量對(duì)SOD活性的影響見表5。

表5 氯仿-乙醇混合溶劑添加量對(duì)SOD活性的影響（SOD 酶活性 U/mg·pro）

上述結(jié)果表明，不同的氯仿-乙醇的混合溶劑的添加量對(duì)酶產(chǎn)品的活性是差異是極顯著水平（F=32.131**，見表7）。40%~50%差異不顯著（顯著性檢驗(yàn)表略），不同的植物雜質(zhì)種類和量不一樣。因此，有機(jī)溶劑除雜的量是不同的。對(duì)于神州草加入總清液體積的40%~50%氯仿-乙醇（3∶5） 混合溶劑效果最好。

2.5 丙酮加倍量的確定

去雜后的清液中加入不同體積丙酮，測定SOD酶的活性。

不同體積丙酮加倍量對(duì)酶活的影響見表6。

表6 不同體積丙酮加倍量對(duì)酶活的影響（SOD 酶活性 U/mg·pro）

上述結(jié)果表明，不同體積丙酮加倍量的沉淀物SOD活性差異是極顯著水平（F=1 584**，見表7），1.0，1.2，1.4加倍量差異不顯著（顯著性檢驗(yàn)表略），0.6加倍量的沉淀物大多為雜質(zhì)。因此，再次純化時(shí)可以采用先加入0.6倍丙酮，離心除雜，然后再補(bǔ)加到1倍丙酮。對(duì)于神州草加入總清液體積的1.0~1.2倍丙酮效果最好。

方差分析見表7。

表7 方差分析

2.6 SOD的純化

向SOD粗品（約0.6 g）中加入10~15 mL（預(yù)冷去離子水的加量視沉淀的多少而定） 的預(yù)冷去離子水重溶解，以轉(zhuǎn)速7 000 r/min冷凍離心，上清液預(yù)冷后，加入總體積30%的氯仿-乙醇混合溶液除雜，混勻靜置5 min，以轉(zhuǎn)速7 000 r/min冷凍離心6 min，吸取上清液，放置冰箱中冷凍備用，下相用于回收氯仿。上清液中加入0.5倍丙酮除雜，然后補(bǔ)加到1.0~1.2倍體積的預(yù)冷丙酮，混勻靜置2 h，以轉(zhuǎn)速7 000 r/min冷凍離心6 min，所得沉淀冷凍干燥后即為SOD產(chǎn)品。按照優(yōu)選出的分離提取及純化工藝重復(fù)5次試驗(yàn)，測定產(chǎn)品SOD活性。

不同純化批次SOD酶活性見表。

表8 不同純化批次SOD酶活性8/U·（mg·pro）-1

3 結(jié)論

由于不同植物漿汁的pH值、SOD含量、色素、雜質(zhì)種類和含量均不一樣，因此浸提液的pH值、激活劑加量、脫色時(shí)間及有機(jī)溶劑除雜加量也不相同。對(duì)于神州草，pH值7.8的0.9%氯化鈉溶液為最佳提取液，激活劑最佳用量是125~150 μL/40 mL酶液，加入濃縮液體積的1.25%的活性炭和1.25%活性白土進(jìn)行20 min脫色，加入總清液體積的40%~50%氯仿-乙醇（3∶5） 混合溶劑，加入總清液體積的1.0~1.2倍丙酮效果最好。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，最終確定神州草SOD的最佳提取工藝流程。

神州草SOD提取工藝流程圖見圖1。

圖1 神州草SOD提取工藝流程圖