□ 趙德錕 張帆 杭州大微生物技術(shù)有限公司

□李杜娟 鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所

食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，隨著人們生活水平的提升，以及對(duì)檢驗(yàn)?zāi)芰σ蟮奶岣?，致病菌檢驗(yàn)與鑒定已成為食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室中最基本且重要的工作之一。采用恰當(dāng)?shù)蔫b定手段，及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒定出食品樣品中的疑似致病菌是保證食品安全的關(guān)鍵，也是國家監(jiān)管部門和企業(yè)實(shí)驗(yàn)室中檢驗(yàn)工作者共同努力的方向。本文分析了食源性致病微生物鑒定的兩類主流技術(shù)，提出生化鑒定方法和經(jīng)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)的微生物鑒定金標(biāo)準(zhǔn)。最終顯示，食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室采用自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，有助于降低致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)食品安全保障體系的健全。

1 致病菌檢驗(yàn)和鑒定技術(shù)在食品安全保障中的重要性

食品安全一直是我國重大的公共衛(wèi)生問題，隨著人們生活水平的不斷提高，微生物對(duì)食品的污染問題也愈發(fā)受到關(guān)注。其中，食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，其在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)中均有存在的可能。消費(fèi)者一旦誤食被食源性致病菌污染的食品，極易引起食物中毒，還易導(dǎo)致各類食源性疾病的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命。同樣，食品生產(chǎn)企業(yè)一旦發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)品被食源性致病菌污染，將會(huì)受到產(chǎn)品召回、停產(chǎn)、整頓及罰款等處罰而承擔(dān)重大的經(jīng)濟(jì)損失。2019年，國家市場監(jiān)督管理總局頒布新規(guī)—《食品安全抽樣檢驗(yàn)管理辦法》，要求食品生產(chǎn)經(jīng)營者收到市場監(jiān)管部門的致病菌檢驗(yàn)項(xiàng)目不合格的通報(bào)后，應(yīng)當(dāng)立即封存不合格食品，暫停生產(chǎn)、經(jīng)營，并召回已銷售的不合格食品；涉嫌犯罪的，依法及時(shí)移送公安機(jī)關(guān)。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測和鑒定出食品樣品中的疑似致病菌，是將風(fēng)險(xiǎn)降至最低以保證食品安全的關(guān)鍵，也是國家監(jiān)管部門和食品企業(yè)實(shí)驗(yàn)室中微生物檢驗(yàn)工作者努力的方向。

目前，我國GB 4789食品安全系列標(biāo)準(zhǔn)和國家食源性致病菌監(jiān)測目錄中，大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌、霍亂弧菌、副溶血性菌及空腸彎曲菌等均屬于被要求檢驗(yàn)的致病菌。除此之外，還有其他相關(guān)法律法規(guī)也對(duì)食品中食源性致病菌的定性檢查提出了明確要求，如表1、表2所示。根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，在食源性病原菌檢測過程中，若檢測結(jié)果呈陽性，則需采用生化試驗(yàn)或微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)的鑒定以確定其屬、種。因此，近年來微生物鑒定技術(shù)也逐漸成為食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室亟需加強(qiáng)的重要技術(shù)能力之一。

表1 國家法規(guī)對(duì)食源性致病菌檢驗(yàn)和鑒定的要求

2 食源性致病微生物鑒定的主流技術(shù)及應(yīng)用特點(diǎn)

關(guān)于食源性致病微生物鑒定的主流技術(shù)主要分為兩類，即常規(guī)鑒定技術(shù)和分子水平鑒定技術(shù)。

微生物常規(guī)鑒定技術(shù)是根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)微生物進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化水平的分類及鑒定。由于部分微生物形態(tài)比較單一而容易分辨，可根據(jù)其形態(tài)直接判斷。雖然大部分微生物形態(tài)較為相近，但由于其具有不同的酶系統(tǒng)，且對(duì)營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也有所不同，因此可在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，通過微生物細(xì)胞壁組成、發(fā)酵產(chǎn)物、代謝情況、對(duì)碳源或氮源等營養(yǎng)成分利用的生化反應(yīng)進(jìn)行綜合判斷，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)分類和鑒定。

分子水平鑒定技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)檢測和DNA檢測。當(dāng)前，蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)主要利用飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得微生物特征蛋白質(zhì)分子的“指紋圖譜”，之后通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)來實(shí)現(xiàn)；DNA檢測的鑒定技術(shù)則是利用細(xì)菌核糖體上的16SrDNA基因進(jìn)化速度緩慢的特點(diǎn)，通過檢測同源基因來實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)常用的手段包括16SrDNA測序、PFGE（脈沖場凝膠電泳）和全基因組測序等技術(shù)。

從當(dāng)前的應(yīng)用情況來看，兩類微生物鑒定技術(shù)各有優(yōu)劣。分子鑒定技術(shù)雖然快速、通量高、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，但樣品前處理過程和結(jié)果分析過程對(duì)操作人員的要求較高，且儀器價(jià)格昂貴、一次性投入較大，因此暫未被納入食品安全檢測標(biāo)準(zhǔn)中。生化鑒定方法雖然鑒定時(shí)間較長，但因操作流程標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果分析難度低、鑒定準(zhǔn)確性較高，且能直接反應(yīng)出微生物的生化特性，因此該方法一直被全球許多國家確認(rèn)為是法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)中的微生物鑒定金標(biāo)準(zhǔn)，是不可替代的實(shí)驗(yàn)室主流鑒定技術(shù)之一。

3 DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)

為實(shí)現(xiàn)對(duì)食品終產(chǎn)品檢測和加工過程監(jiān)控中采樣的細(xì)菌、酵母菌等微生物進(jìn)行便捷、可靠的菌種鑒定，杭州大微生物技術(shù)有限公司結(jié)合多年工業(yè)微生物檢測方面的經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)積累，推出了DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，如圖1所示。通過一系列突破性創(chuàng)新，該系統(tǒng)除操作更加方便且人性化外，還優(yōu)化和擴(kuò)大了微生物數(shù)據(jù)庫，具有簡便的操作流程和高效準(zhǔn)確的鑒定能力，不僅適用于各種類型樣品（食品、農(nóng)產(chǎn)品、藥品、化妝品、質(zhì)控樣、模擬樣品及環(huán)境監(jiān)測樣品等）的微生物鑒定，還適用于市場監(jiān)督管理部門、海關(guān)出入境檢驗(yàn)檢疫、疾病預(yù)防控制、食品安全、制藥、企業(yè)、獸醫(yī)、漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖等微生物檢測實(shí)驗(yàn)室。

3.1 工作原理

DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)利用不同細(xì)菌具有不同酶系統(tǒng)的特點(diǎn)和對(duì)底物的不同分解能力，以生化反應(yīng)原理（底物反應(yīng)、糖利用反應(yīng)、同化反應(yīng)、氨基酸實(shí)驗(yàn)等）為基礎(chǔ)，通過微生物激光透射比色法捕獲細(xì)菌的生化表型特征，并采用數(shù)值分類原理，自動(dòng)比對(duì)專用微生物數(shù)據(jù)庫，對(duì)各種類型樣品的微生物單分離株進(jìn)行自動(dòng)分類和鑒定。

3.2 系統(tǒng)特點(diǎn)

3.2.1 操作方便簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠

工作流程可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，僅需4步（革蘭氏染色與鏡檢→試劑板選擇→加樣及培養(yǎng)→上機(jī)自動(dòng)鑒定）即可完成鑒定全流程；實(shí)驗(yàn)結(jié)果無需人工干預(yù)，可全部由計(jì)算機(jī)自動(dòng)完成判讀，并調(diào)取數(shù)據(jù)庫信息，得出鑒定結(jié)果。同時(shí)，由于DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)將多個(gè)生化反應(yīng)有效整合并濃縮于96孔板卡上，不僅增加了生化反應(yīng)數(shù)量，還實(shí)現(xiàn)了微量培養(yǎng)與檢測，在檢測準(zhǔn)確性和速度上都得到大幅提高，最快可當(dāng)天獲得結(jié)果。

3.2.2 擁有廣泛的鑒定范圍

微生物鑒定試劑板是根據(jù)不同種類微生物專門設(shè)計(jì)而成，為更大程度地?cái)U(kuò)大鑒定范圍，DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)配套16種鑒定板條，鑒定范圍覆蓋絕大多數(shù)微生物，適用于腸桿菌、非發(fā)酵菌、葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、陽性桿菌、弧菌、陰性球菌、酵母菌、嗜血桿菌、厭氧菌、彎曲桿菌、支原體、分枝桿菌等微生物的檢測。

3.2.3 提供龐大的專業(yè)數(shù)據(jù)庫支撐

數(shù)據(jù)庫是鑒定系統(tǒng)能否準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的關(guān)鍵因素，DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)的菌種信息數(shù)據(jù)庫在2000種以上，可定性鑒定微生物數(shù)量為550種以上；當(dāng)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫以外的未知少見菌種時(shí)，還可結(jié)合實(shí)驗(yàn)室需求進(jìn)行菌種信息和生化反應(yīng)表型的人工擴(kuò)充，進(jìn)而使數(shù)據(jù)庫不斷豐富和完善。

圖1 DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)

基于以上特點(diǎn)，DW-M80自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)已經(jīng)成為食品檢測實(shí)驗(yàn)室中微生物檢測的日常鑒定手段。除微生物生化鑒定功能外，該系統(tǒng)還可實(shí)現(xiàn)微生物對(duì)抗生素耐藥性的檢測及MIC值測定，滿足抑菌實(shí)驗(yàn)的需求。

4 結(jié)語與展望

近年來，隨著儀器分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，自動(dòng)化微生物鑒定技術(shù)逐步發(fā)展起來，大大促進(jìn)了食品檢測技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程，并正被廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測和鑒別中。由于自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)采用經(jīng)典的微生物生理生化反應(yīng)原理，具有操作簡單、標(biāo)準(zhǔn)化、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，現(xiàn)階段仍是食物樣品中微生物鑒定的基本方法，也是分子鑒定結(jié)果的根本驗(yàn)證手段。

此外，若食品生產(chǎn)單位能有效使用微生物生化鑒定系統(tǒng)，對(duì)生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)過程，以及出廠最終產(chǎn)品進(jìn)行有效監(jiān)控，了解微生物分布情況，及時(shí)分析微生物污染來源等，有助于降低微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量安全保障體系的健全。

表2 食品安全檢測實(shí)驗(yàn)室的致病菌鑒定項(xiàng)目需求與標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)