肖正紅，謝廣倫，翟煥閣，王蘇芳

1)南陽(yáng)南石醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 河南南陽(yáng) 473065 2)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院疼痛科 鄭州450008

腎癌是一種發(fā)展速度快、早期臨床癥狀不明顯的常見惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，多種基因在腎癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]?；虬邢蛑委熞呀?jīng)成為腎癌治療的有效途徑[2]。不同于正常細(xì)胞，有氧糖酵解是腫瘤細(xì)胞特有的能量供應(yīng)方式，無(wú)論是有氧還是乏氧條件下腫瘤細(xì)胞均以糖酵解為主要代謝途徑，研究腫瘤細(xì)胞糖酵解機(jī)制對(duì)于闡明腫瘤發(fā)病機(jī)制具有重要意義[3]。Twist是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]。目前的研究[5-7]顯示，Twist是一種癌基因，在多種腫瘤組織如腎癌、胃癌、宮頸癌等組織中高表達(dá)，敲低其表達(dá)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。已經(jīng)證實(shí)Twist具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞能量代謝的作用[3]。己糖激酶2(HK2)和丙酮酸激酶M2亞型(PKM2)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶。本實(shí)驗(yàn)利用shRNA技術(shù)下調(diào)腎癌細(xì)胞A498中Twist的表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶PKM2、HK2表達(dá)水平及糖酵解代謝水平的變化，為闡明腎癌分子發(fā)病機(jī)制及靶向Twist治療提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源及主要試劑、儀器A498購(gòu)自美國(guó)ATCC，細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中添加青、鏈霉素。ATP含量檢測(cè)試劑盒、乳酸含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司，葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Twist shRNA(序列為GCGCTAGAATGTACTCGTTAC)和陰性對(duì)照(shRNA-NC)由北京百奧川生物科技有限責(zé)任公司合成,將shRNA序列載入pGPU6-GFP-Neo表達(dá)載體, 構(gòu)建pGPU6-Twist-GFP-Neo慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司； Twist抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology，HK2、PKM2抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG)購(gòu)自上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)分組將A498細(xì)胞分成3組：Twist shRNA、shRNA-NC、空白對(duì)照組。Twist shRNA、shRNA-NC組細(xì)胞分別穩(wěn)定感染Twist shRNA慢病毒和shRNA-NC慢病毒，空白對(duì)照組不做慢病毒感染。A498培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為30%時(shí)，添加病毒液(MOI=20)，繼續(xù)孵育10 h后，吸棄上清，添加細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光水平。用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中Twist mRNA 和蛋白的表達(dá)，以評(píng)估沉默效果。

1.3細(xì)胞中Twist mRNA 和蛋白表達(dá)的檢測(cè)①qRT-PCR：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，操作同試劑說(shuō)明書。取0.5 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃10 min。PCR引物：Twist 正義鏈 5’-GTGGACAGTGATTCCCAGACGG-3’，反義鏈 5’-CAGTGGCTGATTGGCACGACCT-3’；GAPDH正義鏈 5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAG CAGG-3’，反義鏈 5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGT GTCG-3’。引物均由上海英駿公司合成。PCR反應(yīng)條件為95 ℃10 s；95 ℃10 s，58 ℃30 s，共循環(huán)40次。以未加細(xì)胞的培養(yǎng)液為對(duì)照。Twist mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。②Western blot：提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法檢測(cè)濃度后，行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，于50 g/L牛血清白蛋白封閉液中室溫放置1.5 h。再將NC膜置于含有一抗(Twist抗體以1∶400稀釋，GAPDH抗體以1∶1 000稀釋)的平皿內(nèi)，4 ℃過(guò)夜，再于二抗(以1∶3 000稀釋)孵育液中室溫反應(yīng)2 h，ECL發(fā)光。利用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)條帶灰度值，以Twist與GAPDH條帶灰度值的比值表示Twist蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖分別取3組細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，每孔104個(gè)，培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μL的MTT溶液孵育4 h，去上清，添加150 μL的DMSO，10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組光密度值/培養(yǎng)液對(duì)照光密度值×100%。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力分別取3組細(xì)胞，配制成2 000個(gè)/mL的懸液，吸取100 μL到60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，加5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),每2 d換液1次。14 d后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，甲醇固定，吉姆薩染色，于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落?？寺⌒纬陕?(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中HK2和PKM2蛋白的表達(dá)細(xì)胞分組培養(yǎng)48 h后，用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平，操作同1.3，HK2和PKM2一抗以1∶400稀釋。

1.7乳酸分泌水平、ATP含量和葡萄糖消耗量的檢測(cè)分組培養(yǎng)48 h后，分別收集3組細(xì)胞的培養(yǎng)上清，3 500 r/min離心5 min，收集上清。用乳酸脫氫酶比色法檢測(cè)上清中乳酸含量;用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)上清中葡萄糖含量，并以培養(yǎng)液對(duì)照中的葡萄糖含量與各實(shí)驗(yàn)組上清中葡萄糖含量的差值表示葡萄糖消耗量；用比色法檢測(cè)ATP含量。具體操作均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS21.0分析，3組Twist mRNA，Twist、PKM2、HK2蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞存活率，克隆形成率，ATP含量，乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞中Twist表達(dá)水平的比較Western blot結(jié)果見圖1、表1。Twist shRNA組細(xì)胞Twist mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和shRNA-NC組。

1、2、3：分別為空白對(duì)照組、shRNA-NC組、Twist shRNA組

組別nTwist mRNATwist 蛋白空白對(duì)照組31.00±0.110.45±0.06shRNA-NC組31.01±0.120.43±0.07Twist shRNA組30.36±0.04?0.14±0.03?F44.42428.819P<0.0010.001

*：與空白對(duì)照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.2 3組細(xì)胞存活率和克隆形成率的比較見表2。Twist shRNA組細(xì)胞存活率和克隆形成率均低于空白對(duì)照組和shRNA-NC組。

表2 3組細(xì)胞存活率和克隆形成率的比較

*：與空白對(duì)照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.3 3組細(xì)胞中PKM2、HK2蛋白表達(dá)水平的比較見圖2和表3。Twist shRNA組細(xì)胞中PKM2、HK2蛋白表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和shRNA-NC組。

1、2、3：分別為空白對(duì)照組、shRNA-NC組、Twist shRNA組

組別nPKM2HK2空白對(duì)照組30.36±0.040.68±0.08shRNA-NC組30.35±0.060.67±0.05Twist shRNA組30.19±0.02?0.14±0.03?F14.62587.643P0.005<0.001

*：與空白對(duì)照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

2.4 3組細(xì)胞培養(yǎng)上清中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比較見表4。Twist shRNA組細(xì)胞中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量均較空白對(duì)照組和shRNA-NC組降低。

表4 3組細(xì)胞培養(yǎng)上清中ATP含量、乳酸分泌水平及葡萄糖消耗量的比較μmol/L

組別nATP含量乳酸分泌水平葡萄糖消耗量空白對(duì)照組3147.23±11.2512.85±1.145.17±0.65shRNA-NC組3145.02±13.2013.04±1.265.23±0.52Twist shRNA組394.12±10.51?8.15±0.71?3.15±0.20?F19.75520.36317.213P0.0020.0020.003

*：與空白對(duì)照組和shRNA-NC組比較，P<0.05

3 討論

Twist屬于螺-環(huán)-螺轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員，是一個(gè)進(jìn)化十分保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[8]。Twist在內(nèi)胚層來(lái)源的細(xì)胞和組織中表達(dá)，在成人心臟、骨骼肌、胰腺、腎臟及胎盤等組織中表達(dá)，在腦組織中幾乎不表達(dá)[9]。隨著研究的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)，Twist在乳腺癌、肝癌、宮頸癌等多種類型的癌組織中表達(dá)水平升高[10-12]，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控。敲低Twist可以體外抑制宮頸癌、食管癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可以抑制結(jié)腸癌、胃癌等細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力[13-15]。已有研究[16]顯示，Twist表達(dá)水平升高與腎癌惡性進(jìn)展關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)Twist表達(dá)后，腎癌細(xì)胞的存活能力和克隆形成能力均降低，Twist在腎癌中可能發(fā)揮癌基因的作用。

腫瘤細(xì)胞在氧氣充足條件下仍然優(yōu)先以有氧糖酵解為主要供能方式，這種現(xiàn)象稱為Warburg效應(yīng)，Warburg效應(yīng)也被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一[17-18]。PKM2、HK2是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，二者在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，能夠促進(jìn)糖酵解，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供ATP[19]。Twist作為一種癌基因，不僅與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞的糖酵解過(guò)程有關(guān)。Twist可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中PKM2的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的代謝途徑從氧化磷酸化向糖酵解轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞重塑能量代謝途徑[3,20]。乳酸是糖酵解產(chǎn)物之一，其可以被分泌至細(xì)胞外，檢測(cè)培養(yǎng)上清中乳酸含量可以間接反應(yīng)細(xì)胞糖酵解水平[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)Twist后腎癌細(xì)胞中PKM2、HK2蛋白的表達(dá)降低，ATP含量下降，乳酸分泌水平和葡萄糖消耗量下降，說(shuō)明下調(diào)Twist能夠降低糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)，抑制腎癌細(xì)胞有氧糖酵解水平。

總而言之，下調(diào)Twist可能通過(guò)抑制腎癌細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)，減少細(xì)胞合成ATP，從而抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為靶向Twist治療腎癌提供了參考依據(jù)。