郭 丹，閆秀明，楊 亮，石 科

1)河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？蒲袑嶒炛行?鄭州 451191 2)河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校檢驗系生物化學(xué)教研室 鄭州 451191 3)河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校檢驗系微生物與免疫學(xué)教研室 鄭州 451191

HOX基因又名Ⅰ型同源異形盒基因，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，決定胚胎和器官的發(fā)育[1]。研究[2]表明，HOX基因與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，有可能成為癌癥早期診斷和基因治療的分子靶點。因此探討HOX基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，對腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評估具有指導(dǎo)意義[3]。HOX根據(jù)序列的相似性及其在染色體上的位置可以分為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD 四個家族[4]。HOXA6定位于人類染色體7p15.3，全長2 192 bp。據(jù)報道[5-6]HOXA6可以促進結(jié)直腸癌細胞的增殖，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而HOXA6在肺癌細胞中的表達如何，是否對肺癌細胞的增殖和凋亡有影響尚不清楚。本實驗利用慢病毒技術(shù)上調(diào)人肺腺癌A549細胞中HOXA6基因的表達，觀察細胞增殖和凋亡的變化，探討HOXA6是否參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑293T細胞、人正常支氣管上皮BEAS-2B細胞、A549細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。慢病毒載體系統(tǒng)購自上海吉凱基因公司，QIAamp DNA Mini試劑盒購自德國Qiagen公司，胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR引物由上海生工生物公司合成，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，凋亡檢測試劑盒購自凱基生物技術(shù)公司，HOXA6、GAPDH、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax和Bcl-2一抗購自美國Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Nanodrop 100核酸定量分析儀購自美國Thermo公司，流式細胞儀購自美國Bectone Dickson公司。

1.2細胞培養(yǎng)BEAS-2B和A549細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2～3 d傳代。

1.3BEAS-2B和A549細胞中HOXA6mRNA的檢測取對數(shù)生長期細胞，用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行qRT-PCR。HOXA6引物：上游5’-TACACGCGCTACCAGACAC-3’，下游5’-GCGT GGAATTGATGAGCTTGTTT- 3’；GAPDH引物：上游5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游5’- AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’。反應(yīng)體系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，10×擴增緩沖液 2 μL，dNTP 2 μL，模板DNA 0.2 μg，Taq DNA聚合酶0.2 μL，1.5 mmol/L Mg2+1.5 μL,加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃10 min，30個循環(huán)；94 ℃15 s，60 ℃32 s退火延伸。用2-ΔΔCt法計算HOXA6 mRNA的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.4BEAS-2B和A549細胞中HOXA6蛋白的檢測用RIPA提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，加一抗(HOXA6按1∶3 000稀釋，GAPDH按1∶4 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，二抗(按1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，掃描條帶，并用Image J分析。先以BEAS-2B或A549細胞中HOXA6蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為HOXA6蛋白的表達水平，再以A549與BEAS-2B細胞中蛋白表達水平的比值作為A549細胞的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.5HOXA6過表達對A549細胞增殖和凋亡的影響

1.5.1 細胞分組 將A549細胞分為正常對照組(未處理)、陰性對照組(感染陰性對照慢病毒)和HOXA6過表達組(感染HOXA6過表達慢病毒)，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.5.2 3組細胞中HOXA6 mRNA和蛋白的表達 采用qRT-PCR和Western blot法檢測，方法同1.3和1.4。

1.5.3 3組細胞存活率檢測 將細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL的DMSO室溫振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度(A)。細胞存活率=實驗組A/正常對照組A×100%。

1.5.4 3組細胞凋亡檢測 采用Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測。接種細胞至6孔板，4 ℃預(yù)冷的PBS洗細胞2次，用 250 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞。取 100 μL細胞懸液于 5 μL流式管中，加入 Annexin V-APC和 7-AAD 溶液各1 μL ，混勻后室溫避光孵育 10 min，上流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.5.5 3組細胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表達的檢測 收集各組細胞，參照1.4用Western blot法檢測cleaved Caspase-3(一抗按1∶3 000稀釋)、cleaved Caspase-9(一抗按1∶3 000稀釋)、Bax(一抗按1∶2 500稀釋)、Bcl-2(一抗按1∶3 000稀釋)蛋白的表達情況。先以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平，再以實驗組與正常對照組目的蛋白表達水平的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 23.0分析，采用兩獨立樣本t檢驗比較A549和BEAS-2B細胞中HOXA6 mRNA和蛋白的表達。采用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較3組細胞增殖、凋亡情況。采用兩獨立樣本t檢驗比較陰性對照組和HOXA6過表達組HOXA6 的表達、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達和Bax/Bcl-2的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1BEAS-2B細胞和A549細胞中HOXA6表達的比較BEAS-2B細胞和A549細胞中HOXA6 mRNA的表達水平分別為(1.00±0.17)和(0.57±0.03)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.314,P=0.013)。A549細胞中HOXA6 蛋白的相對表達水平為(0.58±0.02)，低于BEAS-2B細胞。

2.2A549細胞中HOXA6表達的比較結(jié)果見圖1和表1。

1：正常對照組；2：陰性對照組；3：HOXA6過表達組

組別nmRNA蛋白陰性對照組30.98±0.030.96±0.07HOXA6過表達組31.65±0.131.55±0.15t8.6716.310P0.0010.003

2.3A549細胞存活率和凋亡率的比較HOXA6過表達組A549細胞存活率降低，凋亡率增加(表2)。

表2 3組A549細胞存活率和凋亡率的比較%

*：與其他兩組相比，P<0.05

2.4A549細胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達和Bax/Bcl-2比值的比較結(jié)果見圖2和表3。

1：正常對照組；2：陰性對照組；3：HOXA6過表達組

組別ncleaved Caspase-3蛋白cleaved Caspase-9蛋白Bax/Bcl-2陰性對照組30.97±0.071.05±0.121.02±0.17HOXA6過表達組32.57±0.473.11±0.352.95±0.18t5.9139.81113.780P0.004<0.001<0.001

3 討論

有研究[7]表明，HOX基因在大多數(shù)實體瘤中被上調(diào)或下調(diào)，而且特定的HOX基因在癌癥中的表達往往會根據(jù)組織類型和腫瘤部位而有所不同。HOX基因在多種腫瘤中表達異常，其表達調(diào)控涉及染色體表觀修飾以及一些信號分子[8-9]。Kishida等[10]報道成人慢性淋巴瘤和兒童急性淋巴瘤中HOXA6基因出現(xiàn)高甲基化，導(dǎo)致HOXA6蛋白表達下調(diào)和功能異常，被鑒定為抑癌基因。有研究[11-13]表明HOXA家族基因在肺癌組織中的表達低于正常肺組織。本研究結(jié)果顯示，與正常支氣管上皮BEAS-2B細胞相比，肺癌A549細胞中HOXA6 mRNA和蛋白的表達水平均下降，與文獻報道一致。

Wu等[5]認為HOXA6過表達抑制了結(jié)直腸癌Caco2和HT-29細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，并誘導(dǎo)了細胞凋亡，而用siRNA抑制HOXA6的表達后表現(xiàn)出相反的作用，可能與HOXA6通過Bcl-2信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡有關(guān)。研究[14]顯示腎透明細胞癌細胞中HOXA6過表達后，細胞存活減少，凋亡增加；而抑制HOXA6表達的腎透明細胞細胞增殖增加，凋亡降低。本文的研究結(jié)果表明，A549細胞HOXA6過表達后細胞存活能力降低，凋亡增加，促細胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的降解產(chǎn)物cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表達亦顯著增高，凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl-2比值增加，提示HOXA6過表達誘導(dǎo)了A549細胞凋亡，機制可能與Bcl-2信號通路有關(guān)。

總之，HOXA6過表達可抑制A549細胞的增殖，可能通過Bcl-2相關(guān)信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。