張 靖，楊 茹，白惠娟

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)婦瘤科 鄭州 450008

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，臨床數(shù)據(jù)[1]顯示，約80%的卵巢癌患者預(yù)后不良，表現(xiàn)出鉑類耐藥，導(dǎo)致化療效果不理想。鼠雙微體(murine doubleminute，MDM)4基因位于人類染色體1q32，其編碼的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與MDM2蛋白高度同源[2]。多種惡性腫瘤的發(fā)生與MDM4基因異常表達(dá)密切相關(guān)[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)MDM4基因在腫瘤化療耐藥中同樣發(fā)揮重要作用。Pellegrino等[5]的研究顯示，MDM4通過介導(dǎo)PI3K/AKT途徑參與肝細(xì)胞癌的發(fā)病和進(jìn)展。還有研究[6-7]表明，PI3K/AKT途徑的異常激活參與順鉑(DDP)耐藥。本實(shí)驗(yàn)通過沉默MDM4在卵巢癌DDP耐藥細(xì)胞A2780/DDP中的表達(dá)，觀察細(xì)胞對(duì)DDP耐藥性及PI3K/AKT信號(hào)通路的變化，為進(jìn)一步闡明卵巢癌DDP耐藥的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780及其DDP耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP、A2780/DDP均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；t-PI3K、p-PI3K、t-AKT、p-AKT、MDM4單抗及IgG二抗均購自美國CST公司；RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000、MDM4 siRNA購自美國Invitrogen公司；MTT購自美國Sigma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染SKOV3、A2780及SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前1 d將A2780/DDP細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，密度為3×105個(gè)/孔，加入不含抗生素、含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長(zhǎng)至40%融合時(shí)，將特異性沉默MDM4基因的重組載體質(zhì)粒pLKO.1-puro-GFP-siRNA-MDM4及陰性對(duì)照pLKO.1-puro-GFP-siRNA-NC(上海鈺博生物科技有限公司)轉(zhuǎn)染至A2780/DDP細(xì)胞，分別記為MDM4 siRNA組和陰性對(duì)照組，將未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A2780/DDP細(xì)胞記為空白對(duì)照組。每組均3個(gè)復(fù)孔。

1.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中MDM4mRNA表達(dá)水平分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3、A2780、SKOV3/DDP和A2780/DDP細(xì)胞，用含0、10、20、40 μmol/L DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的A2780/DDP細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染48 h后的3組A2780/DDP細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，以分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增， 反應(yīng)體系20 μL，其中模板0.8 μL、上下游引物各1 μL、2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，以ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。MDM4上游引物：5’-ACGTTGGATGGA CAACTCAAGTCTAGACCC-3’；下游引物：5’-ACGT TGGATGTGTGTTACCTGTGGCAAGAC-3’。 內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’；下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MDM4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中MDM4、p-PI3K、t-PI3K、p-AKT和t-AKT蛋白表達(dá)水平分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3、A2780、SKOV3/DDP和A2780/DDP細(xì)胞，用含0、10、20、40 μmol/L DDP的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的A2780/DDP細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染48 h后的3組A2780/DDP細(xì)胞，加入蛋白裂解液，置冰上提取總蛋白。以BCA法檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白與加樣緩沖液混勻，加熱15 min使蛋白變性。取等量蛋白樣品加入蛋白上樣孔中，行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，于含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的封閉液中封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗，其中MDM4一抗1∶800稀釋，p-PI3K、t-PI3K、p-AKT、t-AKT一抗均1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，顯影，采用Quantity One軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及耐藥性將3組A2780/DDP細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板中，密度為1×104個(gè)/孔，置37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別加入含0(對(duì)照)、10、20、40 μmol/L DDP的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)基，24 h后每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液后，每孔加入二甲基亞砜溶液150 μL，置振蕩儀上低速振蕩反應(yīng)10 min，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔A/對(duì)照孔A)×100%。繪制生存曲線，計(jì)算DDP對(duì)各組細(xì)胞的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同組間MDM4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量，細(xì)胞增殖抑制率，p-PI3K、t-PI3K、p-AKT和t-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同卵巢癌細(xì)胞中MDM4表達(dá)的比較SKOV3、A2780和SKOV3/DDP、A2780/DDP中MDM4的表達(dá)水平見圖1和表1。可知，與卵巢癌細(xì)胞相比，卵巢癌DDP耐藥細(xì)胞中MDM4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，MDM4在A2780/DDP細(xì)胞中表達(dá)水平最高，故后續(xù)選擇A2780/DDP細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1：SKOV3；2：SKOV3/DDP；3：A2780；4：A2780/DDP

細(xì)胞nMDM4 mRNAMDM4蛋白SKOV331.00±0.090.26±0.03SKOV3/DDP33.22±0.31?0.47±0.05?A278031.36±0.200.21±0.02A2780/DDP34.62±0.41?#△0.67±0.08?#△F109.54152.343P<0.001<0.001

*：與SKOV3細(xì)胞比較，P<0.05；#：與A2780細(xì)胞比較，P<0.05；△：與SKOV3/DDP細(xì)胞比較，P<0.05

2.2不同劑量DDP作用后A2780/DDP細(xì)胞中MDM4表達(dá)的比較結(jié)果見圖2和表2。隨著DDP劑量的升高，A2780/DDP細(xì)胞中MDM4 mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸降低。

2.3沉默MDM4對(duì)A2780/DDP細(xì)胞中MDM4表達(dá)的影響結(jié)果見圖3和表3。MDM4 siRNA組細(xì)胞中MDM4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

1：0 μmol/L DDP；2：10 μmol/L DDP；3：20 μmol/L DDP；4：40 μmol/L DDP

圖2不同劑量DDP作用后A2780/DDP細(xì)胞中MDM4蛋白的表達(dá)

表2 不同劑量DDP作用后A2780/DDP細(xì)胞中MDM4 mRNA和蛋白表達(dá)的比較

*：組間兩兩比較，P均<0.05

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：MDM4 siRNA組

組別nMDM4 mRNAMDM4蛋白空白對(duì)照組31.01±0.100.68±0.07陰性對(duì)照組30.98±0.090.65±0.07MDM4 siRNA組30.22±0.03?#0.16±0.02?#F94.94275.206P<0.001<0.001

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.4沉默MDM4對(duì)A2780/DDP細(xì)胞DDP耐藥性的影響結(jié)果見表4。不同劑量DDP作用后，MDM4 siRNA組細(xì)胞增殖抑制率均高于其他兩組。MDM4 siRNA組的IC50為(10.19±1.62) μmol/L，低于空白對(duì)照組的(29.20±3.53) μmol/L和陰性對(duì)照組的(25.92±3.28) μmol/L(F=107.882，P<0.001)。

表4 不同劑量DDP作用后各組A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制率的比較 %

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.5沉默MDM4對(duì)A2780/DDP細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響結(jié)果見圖4和表5。MDM4 siRNA組中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平均低于其他兩組。

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：MDM4 siRNA組

組別np-PI3Kt-PI3Kp-AKTt-AKT空白對(duì)照組30.15±0.021.21±0.150.18±0.020.87±0.08陰性對(duì)照組30.14±0.021.18±0.110.16±0.020.90±0.09MDM4 siRNA組30.02±0.01?#1.25±0.160.03±0.01?#0.92±0.11F52.3330.18466.3330.214P<0.0010.836<0.0010.813

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

卵巢癌是一種發(fā)病率和病死率較高的婦科惡性腫瘤，晚期卵巢癌患者5 a生存率低于40%[8]。目前治療晚期卵巢癌的主要方法是以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療，但多數(shù)患者對(duì)鉑類化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響了化療效果。MDM4基因在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。該研究結(jié)果顯示，MDM4在卵巢癌DDP耐藥細(xì)胞株的表達(dá)水平明顯升高；以不同劑量DDP干預(yù)A2780/DDP細(xì)胞，結(jié)果顯示DDP干預(yù)后細(xì)胞中MDM4表達(dá)水平明顯降低。將MDM4 siRNA轉(zhuǎn)染到A2780/DDP細(xì)胞中，結(jié)果顯示，沉默MDM4表達(dá)后A2780/DDP細(xì)胞增殖抑制率升高，DDP對(duì)A2780/DDP細(xì)胞的IC50降低，提示沉默MDM4基因能夠降低A2780/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1307通過靶向MDM4調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡參與乳腺癌DDP耐藥的發(fā)展。還有研究[11]顯示，在DDP耐藥的2780CP/Cl-16卵巢癌細(xì)胞中，p53(V172F)突變可促進(jìn)MDM4募集，從而誘導(dǎo)DDP抗性。

PI3K/AKT信號(hào)通路與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。研究[12]顯示，PI3K/AKT信號(hào)通路的活化與DDP、阿霉素等化療藥物的耐藥密切相關(guān)。Yan等[13]發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR通過靶向miR-126激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌DDP耐藥。目前研究[14]已證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路的過度活化參與卵巢癌細(xì)胞DDP耐藥性，抑制該通路能夠明顯降低DDP耐藥性。AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子，p-AKT可激活下游靶基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn)，沉默MDM4后A2780/DDP細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示沉默MDM4能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。因此推測(cè)，沉默MDM4基因的表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路而降低A2780/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性。

總之，MDM4基因參與卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP耐藥性，其作用機(jī)制可能與提高PI3K/AKT信號(hào)通路的活化水平有關(guān)。