邵 華，張 怡，黃 麗，高 敏，馮斐斐

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 鄭州 450001

肺癌已成為世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，由于當(dāng)前肺癌的早期診斷率和遠(yuǎn)期療效仍不夠理想，故對(duì)肺癌的診治手段還需做更多的研究和探索[1]。有研究[2]表明，神經(jīng)纖維瘤蛋白1(neurofibromatosis 1,NF1)可以將活性的RAS-GTP復(fù)合物轉(zhuǎn)換為非活性的RAS-GDP，NF1表達(dá)水平的降低導(dǎo)致RAS信號(hào)通路的持續(xù)激活，進(jìn)而刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。此外NF1缺失還可激活以RAS和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)活性增加為特征的旁路途徑[3]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路的一個(gè)重要因子，能夠被多種刺激因子激活，引起多種內(nèi)在調(diào)控基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)化。譚婧瑾[4]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者肺組織中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。此外，有研究[5]表明炎癥與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，并且已有研究證實(shí)脂多糖(LPS)能夠加速4-(甲基亞硝氨基)-3-吡啶-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,NNK)]誘導(dǎo)的小鼠肺部腫瘤的發(fā)生[6]。故本實(shí)驗(yàn)采用苯并芘[B(a)P][7]替代NNK聯(lián)合LPS染毒，構(gòu)造小鼠炎癥促癌模型，探討NF1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)與炎性相關(guān)肺癌的關(guān)系，從而為其防治提供作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌雄各半，體重20～30 g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物房，自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度為18～22 ℃，晝夜節(jié)律同自然。

1.2實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組：B(a)P聯(lián)合LPS組[B(a)P+LPS組，n=35)、單獨(dú)B(a)P組[B(a)P組，n=35]、單獨(dú)LPS組(LPS組，n=15)和三辛酸甘油酯聯(lián)合生理鹽水組[對(duì)照組，n=15]。B(a)P+LPS組小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后氣管內(nèi)滴注B(a)p懸浮液，染毒劑量為1 mg/只(溶于50 μL三辛酸甘油酯)，每周1次，連續(xù)4周后停止，B(a)p染毒結(jié)束后記為第0周，第3周進(jìn)行LPS氣管內(nèi)滴注，染毒劑量為2.5 μg/只(溶于50 μL生理鹽水)，每3周1次，給予5次后停止。B(a)p組小鼠氣管內(nèi)滴注1 mg/只的B(a)p懸浮液，每周1次，連續(xù)4周。LPS組每只小鼠氣管內(nèi)滴注2.5 μg/只LPS溶液，每3周1次，連續(xù)給予5次。對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)滴注等體積的三辛酸甘油酯和無菌生理鹽水。

1.3觀察指標(biāo)及方法染毒結(jié)束后，小鼠正常飼養(yǎng)，30周后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察小鼠肺部出現(xiàn)腫瘤的數(shù)量和出現(xiàn)肺癌的小鼠數(shù)，計(jì)算肺癌發(fā)生率和各組小鼠平均腫瘤形成數(shù)。取左側(cè)肺葉固定在40 g/L多聚甲醛中，石蠟包埋，檢測(cè)肺部相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.4肺癌組織中NF1、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)肺組織切片經(jīng)脫蠟水化、抗原修復(fù)、滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，用山羊血清室溫封閉30 min，滴加兔抗小鼠NF1和p-ERK1/2(均按1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜，然后滴加山羊抗兔二抗室溫孵育50 min，最后經(jīng)DAB顯色和蘇木素復(fù)染后脫水封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。山羊抗兔二抗、兔抗小鼠p-ERK1/2抗體和兔抗小鼠NF1抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司；SP雙標(biāo)記染色試劑盒和DAB顯色劑購自武漢谷歌生物技術(shù)有限公司。結(jié)果判定：NF1和p-ERK1/2蛋白以著色呈淺黃色至棕褐色為陽性細(xì)胞。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測(cè)量3個(gè)視野(×200)下陽性區(qū)域面積和累積光密度，通過公式(平均光密度=累積光密度/陽性表達(dá)區(qū)域面積)計(jì)算并分析數(shù)據(jù)[8]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較各組小鼠肺部成瘤率，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)比較各組小鼠平均腫瘤形成數(shù)，應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)比較各組小鼠腫瘤組織中NF1蛋白和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的差異。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析各組肺組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肺部成瘤情況對(duì)照組與LPS組小鼠未形成腫瘤；B(a)p+LPS組小鼠腫瘤形成率(96.97%)高于B(a)p組(82.05%)(χ2=4.028，P=0.045)；B(a)p+LPS組小鼠的平均腫瘤形成數(shù)[10.0(4.0,19.2)]高于B(a)p組[3.0(1.0,6.0)](Z=3.762，P<0.001)。

2.2各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)見圖1、2和表1。NF1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，在癌巢部位多呈低表達(dá)或不表達(dá)，在正常組織中明顯表達(dá)；p-ERK1/2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在癌巢部位多呈高表達(dá)狀態(tài)，在正常組織中散在分布。

2.3各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的相關(guān)性見表2。B(a)p+LPS組兩者的Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.771(P<0.05)，其他3組兩蛋白表達(dá)無相關(guān)性。

A：肺泡；B：細(xì)支氣管；1：對(duì)照組；2：LPS組；3：B(a)p組；4：B(a)p+LPS組

A：肺泡；B：細(xì)支氣管；1：對(duì)照組；2：LPS組；3：B(a)p組；4：B(a)p+LPS組

表1 各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的比較

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與B(a)p組相比，P<0.05

表2 各組小鼠肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展受腫瘤微環(huán)境調(diào)控，慢性炎癥在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著極其重要的作用[9]。腫瘤微環(huán)境中炎性細(xì)胞和因子的長(zhǎng)期存在可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制凋亡。研究[10]發(fā)現(xiàn)LPS作為一種內(nèi)毒素能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過改變腫瘤微環(huán)境而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)LPS作用并不誘發(fā)肺癌，單獨(dú)B(a)p可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生；而與B(a)p組相比，B(a)p+LPS組小鼠的腫瘤形成率升高、小鼠的平均腫瘤形成數(shù)明顯增加，提示LPS確實(shí)可以通過介導(dǎo)炎癥加重B(a)p誘導(dǎo)的肺癌的形成。

NF1基因已被確認(rèn)為抑癌基因，其突變、缺失與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、疾病的療效、預(yù)后，甚至和某些腫瘤的不良抵抗有關(guān)[11]。杜珊等[12]在一項(xiàng)胃癌研究中發(fā)現(xiàn)NF1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率低于正常胃組織，NF1蛋白高表達(dá)組的生存率高于低表達(dá)組。另外，張鵬[13]在對(duì)未分化多形性肉瘤(UPS)的研究中發(fā)現(xiàn)瘤組織中NF1蛋白表達(dá)陽性率低于瘤旁正常肌肉組織。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NF1蛋白在肺部正常組織中明顯表達(dá)，而在癌組織中多呈低表達(dá)或不表達(dá)；與對(duì)照組相比，B(a)p+LPS和B(a)p組NF1蛋白表達(dá)降低，提示NF1可能具有抑癌基因的功能，與以往的研究結(jié)果一致。B(a)p+LPS組NF1蛋白表達(dá)水平與B(a)p組相比亦明顯降低，表明炎癥的存在能夠使肺癌加重。

NF1基因缺失會(huì)引起Ras超活化，隨后導(dǎo)致Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活。 ERK是MAPKs家族的重要成員之一，在絲裂原受相應(yīng)信號(hào)刺激后，ERK接受上游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化為p-ERK進(jìn)入細(xì)胞核，活化細(xì)胞核內(nèi)的某些轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而參與細(xì)胞的調(diào)控及增殖[14-15]。王西潔[16]通過免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNMⅢ～Ⅳ期肺癌組織中p-ERK蛋白表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期，并且高于正常肺組織。本研究結(jié)果顯示，p-ERK1/2蛋白在肺癌組織中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)且散在分布；與對(duì)照組相比，B(a)p+LPS和B(a)p組的p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加，這與上述研究結(jié)果一致。

為了探究肺癌組織中NF1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，本研究進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果表明NF1與p-ERK1/2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這證實(shí)NF1作為RAS蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)產(chǎn)物減少使RAS通路不斷激活，進(jìn)而使下游的ERK磷酸化水平升高[17]。然而B(a)p+LPS組與B(a)p組相比以及LPS組與對(duì)照組相比p-ERK1/2蛋白的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是除了NF1低表達(dá)導(dǎo)致RAS-ERK通路的持續(xù)激活外，還可能有其他的因子參與ERK的調(diào)控，如蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)對(duì)ERK通路的活化。

綜上所述，NF1蛋白在肺癌組織中低表達(dá)，p-ERK1/2蛋白呈高表達(dá)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示NF1作為一種抑癌基因其正常表達(dá)可抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展；低表達(dá)時(shí)RAS下游的RAF/MEK/ERK通路持續(xù)激活，從而使p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞發(fā)生癌變和增殖。探索NF1和p-ERK1/2蛋白在肺癌中的表達(dá)情況，有助于對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更深了解，開辟腫瘤治療新途徑。