周 舫，張 愷，翟若南，薛 騰，任亞南，史鳳顯，馬銘澤，王 航

鄭州大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學教研室 鄭州 450001

肺癌是中國乃至世界范圍內重大的公共衛(wèi)生問題，肺癌患者死亡率高的主要原因之一是肺癌易發(fā)生轉移，這也是肺癌臨床治療上的重、難點問題[1]。上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在肺癌的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉移中發(fā)揮重要作用，經(jīng)歷EMT進程的肺上皮細胞由上皮細胞立方樣形態(tài)向間質細胞紡錘樣形態(tài)轉化，細胞骨架重建，細胞失去極性并產生偽足使細胞的運動能力增強[2]，同時細胞內間質細胞標記蛋白Vimentin、N-cadherin的表達上升，而上皮細胞標記蛋白E-cadherin的表達下降。

近來有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)在發(fā)生轉移的肺癌組織中非吞噬細胞氧化酶4(non-phagocytic cell oxidase 4，NOX4)高表達；此外NOX4也是哺乳動物機體細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要來源。研究[5-6]表明ROS在轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導的EMT進程中發(fā)揮重要作用，TGF-β的刺激可使細胞內ROS的水平升高，而ROS在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中對包括Smads、MAPK等在內的多條細胞信號通路具有調節(jié)作用，影響癌細胞的運動能力。因此，本研究利用TGF-β誘導A549細胞的EMT進程，然后用BAY11-7082特異性地抑制NF-κB的表達，觀察A549細胞NOX4、ROS水平，EMT進程以及細胞遷移能力的變化，從而為控制肺癌轉移提供相應的實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料A549細胞購自中科院上海細胞生物研究所。BCA蛋白濃度測定試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基、NF-κB抑制劑BAY11-7082、二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶生物科技有限公司，胎牛血清購自美國GEMINI公司，TGF-β購自美國Peprotech公司，NF-κB(p65)、磷酸化NF-κB(p65)[p-NF-κB(p65)]、Vimentin抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，NOX4、Snail、GAPDH、E-cadherin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。ECLIPSE TS100-F倒置顯微鏡(日本尼康公司)，Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)，SUNRISE自動酶標儀(奧地利TECAN公司)，DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(美國Bio-Red公司)。

1.2細胞培養(yǎng)使用含有青鏈霉素雙抗和體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基復蘇、培養(yǎng)A549細胞；培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、相對濕度95%。

1.3實驗分組A549細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時，對細胞進行饑餓處理(使用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h)，然后分為空白組、TGF-β組(5.0 μg/L TGF-β)、TGF-β+BAY11-7082組、BAY11-7082組和溶劑(DMSO)對照組。BAY11-7082工作濃度為20 mmol/L，以DMSO為溶劑。處理24 h后，進行以下檢測。

1.4EMT相關蛋白及NF-κB(p65)、NOX4蛋白表達的檢測收集細胞并提取總蛋白，測定蛋白濃度后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔蛋白的上樣量為25 μg。電泳結束轉膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加一抗[NF-κB(p65)和p-NF-κB(p65)抗體按1∶1 000稀釋，Vimentin、E-cadhein、Snail抗體均按1∶2 000稀釋，NOX4抗體按1∶500稀釋，GAPDH抗體按1∶5 000稀釋]，4 ℃孵育過夜，加二抗(按1∶5 000稀釋)，孵育1 h，洗脫3次后加入適量ECL發(fā)光液曝光顯影，結果使用Quantity One軟件進行定量分析。以目的條帶與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.5ROS檢測利用DCFH-DA探針檢測各組細胞的ROS水平，采用流式細胞儀檢測熒光信號的強度，用以反映細胞內ROS的水平。實驗重復3次。

1.6劃痕實驗取處于對數(shù)生長期的A549細胞接種于6孔板，使用無菌的200 μL槍頭在6孔板中心劃一個“十”字形的劃痕，然后用PBS清洗，再按照1.3中分組對細胞進行相應的處理，培養(yǎng)24 h后觀察劃痕寬度的變化，并使用相應圖像處理軟件分析劃痕寬度。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析比較多組間NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、EMT相關蛋白、NOX4蛋白的表達水平以及細胞內ROS水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 5組細胞NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4、ROS水平及EMT相關蛋白表達水平的比較如圖1和表1、2所示，與空白組比較，TGF-β組E-cadherin蛋白的表達水平降低，同時Vimentin、Snail、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4蛋白的表達水平和ROS的水平升高；與TGF-β組相比，TGF-β+BAY11-7082組E-cadherin蛋白的表達升高，同時Vimentin、Snail、NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4蛋白的表達水平和ROS的水平降低，提示BAY11-7082與TGF-β聯(lián)用存在著拮抗作用。

1～5：分別為空白組、TGF-β組、TGF-β+BAY11-7082組、BAY11-7082組和溶劑對照組

圖1 5組細胞NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)、NOX4及EMT相關蛋白的表達

表1 5組細胞NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)及EMT相關蛋白表達水平的比較(n=3)

*：與空白組相比，P<0.001；#：與TGF-β組相比，P<0.001；△：與TGF-β+BAY11-7082組相比，P<0.001

2.2 5組細胞遷移能力比較如表2所示，與空白組相比，TGF-β組劃痕寬度變小，說明TGF-β使細胞的遷移能力增強；而與TGF-β組相比，TGF-β+BAY11-7082組劃痕寬度增大，說明BAY11-7082抑制NF-κB(p65)降低了細胞的遷移能力。

表2 5組細胞NOX4蛋白表達水平、ROS水平及劃痕寬度的比較(n=3)

*：與空白組相比，P<0.001；#：與TGF-β組相比，P<0.001；△：與TGF-β+BAY11-7082組相比，P<0.001

3 討論

肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而肺癌易于向骨、腦以及腎臟等部位轉移，是造成肺癌患者高死亡率的主要原因之一；在肺癌轉移過程中往往伴隨著EMT進程的發(fā)生[7]；而研究[8]表明NF-κB可通過調節(jié)Snail轉錄因子的活化從而對EMT進程產生調控作用。

NF-κB是細胞內最重要的轉錄因子之一，普遍存在于真核細胞內并參與多種基因的轉錄調控，同時NF-κB信號通路的持續(xù)激活與許多惡性腫瘤的發(fā)生以及侵襲轉移過程密切相關[9]。本實驗在TGF-β的誘導下檢測到NF-κB(p65)、p-NF-κB(p65)的水平升高，同時A549細胞發(fā)生EMT進程，具體表現(xiàn)為上皮細胞標志蛋白E-cadherin的表達下降，間質細胞標記蛋白Vimentin的表達上升，而使用NF-κB抑制劑BAY11-7082特異性地降低NF-κB(p65)的表達后，E-cadherin蛋白的表達升高，而Vimentin、Snail蛋白的表達下降，提示TGF-β誘導的EMT進程受抑，同時造成NOX4蛋白表達下降以及ROS的水平降低。有研究[10-11]表明，ROS作為細胞內的第二信使可以通過影響蛋白的磷酸化過程調控細胞內的多條信號通路，比如NOX/ROS/MAPK信號通路、PI3K/Akt/mTOR信號通路等，從而影響Smad、Snail等轉錄因子的表達，進而對EMT進程產生影響。本研究結果顯示抑制NF-κB(p65)的表達可使NOX4來源的ROS的水平降低，低水平的ROS不足以激活相關的信號通路，導致轉錄因子Snail蛋白的表達下降，EMT進程被抑制。相似的，在乳腺上皮細胞中，高水平的ROS誘導的EMT進程同樣受到NF-κB的調控[12]。而在人惡性膠質細胞瘤細胞系U251細胞和U87細胞中發(fā)現(xiàn)，沉默趨化因子受體7(chemokine receptor 7, CCR7)或者用CCR7的中和抗體處理細胞后，可抑制NF-κB的活化，進而使細胞內MMP-2、MMP-9蛋白的表達受到抑制，最終對細胞的侵襲、轉移以及EMT進程產生影響[13]。另有研究[14]顯示，下調CDX2可誘導EMT發(fā)生，從而增強結腸癌細胞的侵襲、遷移能力，提示EMT與腫瘤細胞的侵襲、遷移能力密切相關。本實驗中使用BAY11-7082抑制NF-κB(p65)的表達后造成細胞內ROS水平降低，抑制了A549細胞的EMT進程，使細胞遷移能力下降，和上述研究的結果相符。因此，由以上結果可以推斷出：NF-κB對TGF-β誘導的A549細胞EMT進程具有調節(jié)作用，即TGF-β的刺激使NF-κB(p65)活化，細胞內NOX4、ROS水平升高，進而激活ROS/Snail等信號通路促進細胞的EMT進程。

綜上所述，在A549細胞中，NF-κB介導由TGF-β誘導產生的EMT進程，而抑制NF-κB的活化可抑制NOX4的表達，導致細胞內ROS的水平下降。低水平的ROS不能充分激活ROS/Snail等信號通路，從而抑制了A549細胞的EMT進程并降低細胞的遷移能力。