朱立強(qiáng),張 樂(lè)，李慶華,張彥婷,張璐玉,劉騰飛,關(guān)方霞

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)食管癌的病理組織類型大多數(shù)是鱗癌。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究取得了一些進(jìn)展，但食管鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)仍未揭示，因此分析食管鱗癌組織或細(xì)胞中異常表達(dá)的蛋白，并探究其作用機(jī)制，有助于揭示食管鱗癌的分子機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)。線粒體作為細(xì)胞能量代謝和凋亡的重要細(xì)胞器，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[1]。在氧氣充足的條件下，腫瘤細(xì)胞的能量代謝(即Warburg效應(yīng))主要依賴糖酵解途徑而不是正常的三羧酸循環(huán)[2]；另外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部分促凋亡相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)[3]；以上過(guò)程均與線粒體有關(guān)。Smac/DIABLO(第二線粒體激活劑)基因作為線粒體凋亡通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因，在食管鱗癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)[4]；前期實(shí)驗(yàn)[5]表明，Smac基因過(guò)表達(dá)或者Smac類似物處理都能夠增強(qiáng)化療以及放療對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效果。本研究以Warburg效應(yīng)為切入點(diǎn)，探究Smac過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡和線粒體能量代謝的影響，從而揭示Smac蛋白與線粒體功能之間的相互作用，為食管鱗癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料食管鱗癌Eca109和EC1細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。含Smac過(guò)表達(dá)載體和空載體的慢病毒購(gòu)自上海GenePharma公司，細(xì)胞全蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，β-actin、Smac、細(xì)胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2、Caspase-3前體、己糖激酶Ⅱ(HK2)、乳酸脫氫酶(LDH)蛋白一抗、二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)購(gòu)自以色列BI公司，胰蛋白酶及RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，過(guò)氧化氫購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Eca109和EC1細(xì)胞均以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、狀態(tài)和密度，待生長(zhǎng)密度達(dá)70%～80%時(shí)傳代。1～2 d換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3Smac過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)前1天接種3 000～5 000個(gè)Eca109或EC1細(xì)胞于96孔板，加入100 μL完全培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，感染復(fù)數(shù)選為10，將含Smac過(guò)表達(dá)載體和含空載體的慢病毒分別感染Eca109和EC1細(xì)胞(分別為過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組)，并用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。以未感染細(xì)胞為空白對(duì)照組。收集細(xì)胞，提取總蛋白，定量后，采用SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后將膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L的脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入Smac蛋白一抗(按1∶1 000稀釋)，以β-actin(抗體按1∶2 000稀釋)為內(nèi)參，4 ℃孵育過(guò)夜，然后室溫條件下加山羊抗兔二抗(按1∶2 000稀釋)孵育2 h，ECL顯像，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。Smac蛋白表達(dá)水平以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4過(guò)氧化氫干預(yù)后細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè)采用JC-1熒光探針?lè)āＨmac過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，用300 μmol/L過(guò)氧化氫處理3 h，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。PBS洗滌2～3次后，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基和1 mL的JC-1染色工作液，充分混勻，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min，隨后加入1 mL的JC-1染色緩沖液洗2次，最后加入2 mL完全培養(yǎng)液置于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。線粒體膜電位以綠/紅熒光比表示,比值升高表示線粒體膜電位降低。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5過(guò)氧化氫干預(yù)后細(xì)胞凋亡率檢測(cè)采用Annexin V-FITC/PI雙染法。將Smac過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞分別接種到6孔板中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。用300 μmol/L過(guò)氧化氫處理細(xì)胞3 h，用PBS清洗2次，然后用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，再用500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL PI混勻，室溫避光放置15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6過(guò)氧化氫干預(yù)后細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和Warburg效應(yīng)關(guān)鍵蛋白表達(dá)的檢測(cè)用300 μmol/L的過(guò)氧化氫誘導(dǎo)Smac過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞損傷后，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C、Bcl-2、Caspase-3前體的表達(dá)情況；同時(shí)，采用Western blot法檢測(cè)慢病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)(第1、3、7天)細(xì)胞內(nèi)Warburg效應(yīng)關(guān)鍵蛋白(HK2、LDH)的表達(dá)。方法同1.3，Smac、Cyt-C、Bcl-2、Caspase-3前體、HK2、LDH一抗均按1∶1 000稀釋。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組Smac蛋白、LDH和HK2蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較過(guò)氧化氫干預(yù)后陰性對(duì)照組和Smac過(guò)表達(dá)組線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率及Smac、Cyt-C、Bcl-2和Caspase-3前體蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1Smac過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的鑒定Western blot結(jié)果見(jiàn)圖1。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，Smac過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中Smac的表達(dá)水平升高(表1)，提示成功構(gòu)建了Smac過(guò)表達(dá)細(xì)胞株。

1～3：分別為Eca109細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及Smac過(guò)表達(dá)組；4～6：分別為EC1細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及Smac過(guò)表達(dá)組

圖1兩種細(xì)胞不同組別Smac蛋白的表達(dá)

表1 兩種細(xì)胞不同組別Smac蛋白表達(dá)水平比較(n=3)

*:與其他2組相比，P<0.05

2.2Smac過(guò)表達(dá)對(duì)過(guò)氧化氫干預(yù)后Eca109和EC1細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的影響過(guò)氧化氫處理后，與陰性對(duì)照組相比，Smac過(guò)表達(dá)組細(xì)胞線粒體膜電位(圖2)降低(綠/紅熒光比升高)，細(xì)胞凋亡率升高(表2)。Bcl-2和Caspase-3前體蛋白的表達(dá)下調(diào)，Cyt-C蛋白的表達(dá)升高(圖3，表3、4)。

圖2 Smac過(guò)表達(dá)對(duì)過(guò)氧化氫干預(yù)后Eca109和EC1細(xì)胞線粒體膜電位的影響(×200)

表2 Smac過(guò)表達(dá)對(duì)Eca109和EC1細(xì)胞綠/紅熒光比和細(xì)胞凋亡率的影響(n=3)

1、2：Eca109細(xì)胞的陰性對(duì)照組和Smac過(guò)表達(dá)組；3、4：EC1細(xì)胞的陰性對(duì)照組和Smac過(guò)表達(dá)組

圖3Smac過(guò)表達(dá)對(duì)凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 Smac過(guò)表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

*:與陰性對(duì)照組相比，P<0.05

表4 Smac過(guò)表達(dá)對(duì)EC1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

*:與陰性對(duì)照組相比，P<0.05

2.3Smac過(guò)表達(dá)對(duì)Eca109和EC1細(xì)胞Warburg效應(yīng)關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響與陰性對(duì)照組相比，Smac過(guò)表達(dá)組HK2和LDH的表達(dá)隨著時(shí)間的推移逐漸降低(圖4、表5)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)Smac蛋白可促進(jìn)Eca109和EC1細(xì)胞的糖酵解作用。

上：Eca109細(xì)胞；下：EC1細(xì)胞；1～4：分別為陰性對(duì)照組，Smac過(guò)表達(dá)組1、3、7 d

圖4 Smac過(guò)表達(dá)對(duì)Eca109和EC1細(xì)胞Warburg效應(yīng)關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

*:與陰性對(duì)照組相比，P<0.05

3 討論

線粒體作為細(xì)胞能量代謝和不可逆的凋亡反應(yīng)中重要的細(xì)胞器，在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了雙重作用。腫瘤細(xì)胞的能量變化(Warburg效應(yīng))影響線粒體的代謝功能，是影響腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制之一，現(xiàn)已成功應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床診斷中，是未來(lái)腫瘤治療的新方向[5-7]。腫瘤細(xì)胞利用有氧糖酵解過(guò)程產(chǎn)生的大量代謝前體物質(zhì)滿足快速增殖對(duì)于大分子合成代謝的需要[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)Smac過(guò)表達(dá)后食管鱗癌細(xì)胞中LDH蛋白的表達(dá)下調(diào)，而代表細(xì)胞糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵限速酶HK2的表達(dá)也下降，說(shuō)明Smac基因的過(guò)表達(dá)可有效限制腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)。

Smac基因位于12號(hào)染色體的長(zhǎng)臂端，可編碼239個(gè)氨基酸，合成相對(duì)分子質(zhì)量為27 000的Smac前體蛋白[9]，其氨基端的前55個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成了線粒體靶向序列(mitochondrial targeting sequence,MTS)，確保Smac前體蛋白定位在線粒體膜。當(dāng)受到外界凋亡刺激(如氧化損傷)時(shí)，Smac前體蛋白的MTS被剪切后，形成21 000的成熟Smac蛋白，從線粒體膜間隙進(jìn)入到胞質(zhì)中，過(guò)程伴隨著Cyt-C的釋放，隨后引發(fā)凋亡程序[10]。細(xì)胞線粒體膜電位的變化是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志之一。本研究采用線粒體膜電位法檢測(cè)了Smac過(guò)表達(dá)的食管鱗癌Eca109和EC1細(xì)胞在過(guò)氧化氫刺激后細(xì)胞早期凋亡情況，同時(shí)采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)了細(xì)胞晚期凋亡，并檢測(cè)了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Cyt-C、Bcl-2、Caspase-3前體)的變化情況，結(jié)果表明Smac在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用，其機(jī)制可能與Smac/Cyt-c-IAP-Caspase-3信號(hào)通路有關(guān)，這與之前的研究[11-12]結(jié)果一致。

綜上所述，本文驗(yàn)證了Smac蛋白通過(guò)線粒體凋亡通路引發(fā)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程，而且首次在能量代謝水平上揭示了Smac基因的影響，為進(jìn)一步揭示食管鱗癌細(xì)胞線粒體功能代謝機(jī)制提供了可能性。