陳美琦 毛會秀 李佳懌 王舒玉 郝普雨 王俊香

摘 ?????要：研究了麻蛇子粉中蛋白質(zhì)和多糖的最佳提取工藝。通過超聲水提的方法，以蛋白質(zhì)和多糖得率為指標，考察提取時間、pH值、料液比對提取物中蛋白和多糖得率的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗，得到麻蛇子粉的最佳提取工藝。結(jié)果麻蛇子粉中蛋白質(zhì)和多糖的最佳提取工藝為提取時間30 min，pH=9，料液比1∶40 g/mL，在這個條件下，蛋白質(zhì)得率為12.48%，多糖得率為0.55%，且綜合評分最高。通過雙指標優(yōu)化麻蛇子粉水提工藝，可以同時兼顧蛋白及多糖兩種抗腫瘤有效成分，獲得具有優(yōu)良抗腫瘤活性的水提液，可為后續(xù)抗腫瘤實驗的深入研究提供基礎(chǔ)。

關(guān) ?鍵 ?詞：麻蛇子粉;超聲提取;正交實驗;蛋白質(zhì);多糖

中圖分類號：R360.4010 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）06-1213-04

Abstract： The optimum extraction technology of protein and polysaccharide from lizard powder was studied. The effects of extraction time， pH value and solid-liquid ratio on the yields of protein and polysaccharide by using ultrasonic water extraction method were investigated. On the basis of single factor experiment， orthogonal experiment was carried out to obtain the best extraction technology of lizard powder. The optimal extraction conditions of protein and polysaccharide in lizard powder were determined as follows： extraction time 30min， pH=9， solid-liquid ratio 1：40. Under above condition， protein yield was 12.48%， polysaccharide yield was 0.55%， and the comprehensive score was the highest. By optimizing the water extraction process of lizard powder with two indexes， effective anti-tumor components of protein and polysaccharide can be taken into account at the same time， and the water extract with excellent anti-tumor activity can be obtained. The paper can provide a basis for the further study of anti-tumor experiments.

Key words： Lizard powder;Ultrasonic extraction;Orthogonal test;Protein;Polysaccharide

麻蛇子又名馬蛇子、蜥蜴[1]，蛇獅子、石龍子。為蜥蜴科麻蜥屬動物麗斑麻蜥（Eremias argus Peter）的全體。生活于干燥地區(qū)，行動迅速，捕食昆蟲，分布于東北及河北、山西、內(nèi)蒙古、江蘇、安徽、山東、河南、陜西、甘肅、青海、寧夏等地區(qū)。在中藥古典文獻中有許多關(guān)于麻蛇子的記載，如：“消癭散瘰，治淋巴結(jié)結(jié)核?！盵1]“鎮(zhèn)靜，滋陰止咳。主治癲癇，喘咳，慢性濕疹，淋巴結(jié)核。”“活血祛瘀，消癭散結(jié)，解毒 、鎮(zhèn)靜。治骨折，淋巴結(jié)核，氣管炎，羊癇風(fēng)等。”[2]“（治）骨結(jié)核及骨髓炎等。”[3]等?，F(xiàn)代對麻蛇子的研究在調(diào)研方面較多，實驗方面研究很少，正因如此，對麻蛇子實驗研究具有現(xiàn)實的意義。傳統(tǒng)上麻蛇子煎煮口服，但麻蛇子是蟲類中藥，含蛋白較多，煎煮溫度太高，蛋白質(zhì)易被破壞，為此研究超聲水提工藝，有利于提高藥物抗腫瘤效果。本課題運用超聲水提的方法，采用紫外可見分光光度法，以麻蛇子粉中蛋白質(zhì)和多糖得率為指標優(yōu)化水提工藝。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

超聲波清洗器KQ-500E型：昆山市超聲儀器有限公司;循環(huán)水式真空泵SHB-III：鄭州長城科工貿(mào)有限公司; PHS-25pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6：上海梅香儀器有限公司;電子天平A1004N：上海精密科學(xué)儀器有限公司等。

1.2 ?試劑

麻蛇子（安徽亳州中藥材市場）經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高德民副教授鑒定為正品;BSA牛血清蛋白、福林酚（BR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）;酒石酸鉀鈉、苯酚、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、硫酸銅等試劑。

2 ?實驗方法

2.1 ?蛋白質(zhì)含量測定[4]

2.1.1 ?牛血清白蛋白溶液對照品的配制

用小燒杯精密稱取牛血清白蛋白對照品20.00 mg，用蒸餾水溶解后放入100 mL容量瓶中，得到200μg/mL標準蛋白質(zhì)溶液，保留備用。

2.1.2 ?堿性銅溶液的配置

首先配置0.1 mol/L的酒石酸鉀鈉，0.04 moL/L的硫酸銅，4%碳酸鈉，0.8%氫氧化鈉，然后取0.1 mol/L酒石酸鉀鈉0.5 mL， 0.04 mol/L硫酸銅0.5 mL， 4%碳酸鈉25 mL， 0.8%氫氧化鈉25 mL，混合均勻，得到堿性銅溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.3 ?標準曲線的繪制

精密量取樣品0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，然后分別放入具塞試管中，加入蒸餾水，使所有試管中的液體均為1 mL，分別加入2.1.2項下配置好的堿性銅溶液5.0 mL，混合均勻，室溫放置10 min，快速精密加入避光密封保存的福林酚試劑0.5 mL，室溫放置30 min后，在紫外分光光度下650 nm測定其吸光度。

2.1.4 ?樣品中蛋白質(zhì)含量的測定

精密吸取樣品溶液2 mL，置于具塞試管，加入配置好的堿性銅溶液5.0 mL，混合均勻，室溫放置10 min， 精確快速加入福林酚試劑0.5 mL， 室溫放置30 min，在紫外分光光度下650 nm測定吸光度。用以下公式測定樣品中蛋白得率：

2.2.1 ?葡萄糖對照品溶液的配制

將葡萄糖用105 ℃的烘箱干燥至恒重，稱取對照品10.00 mg，加水溶解后，放入100 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

2.2.2 ?標準曲線的制備

分別精密量取對照品溶液0，1，2，3，4，5 mL，分別放入10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，分別量取2 mL，放入10 mL具塞試管中。分別加入5%的苯酚溶液1 mL，混合均勻，迅速精密加入濃硫酸 5 mL，混合均勻，室溫放置10 min后，置40 ℃水浴鍋中保溫15 min，取出后冷卻至室溫，在490 nm波長處測定吸光度。

2.2.3 ?樣品中多糖含量的測定

取2 mL麻蛇子粉水提液于試管中，加入5%的苯酚溶液1 mL，混合均勻，快速精密加入濃硫酸5 mL，混合均勻，室溫放置10 min，置40 ℃水浴鍋中保溫15 min，取出后冷卻至室溫，在紫外分光光度490 nm波長處測定吸光度。用以下公式測定樣品中多糖得率：

2.3 ?提取流程

精密稱取麻蛇子粉1.000 0 g，按照料液比加入一定量的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值，在一定溫度，時間下超聲提取，提取液離心、抽濾，藥渣重復(fù)提取一次，將兩次所得上清液定容到容量瓶中，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 ?單因素實驗的設(shè)計

2.4.1 ?超聲時間對蛋白質(zhì)和多糖得率的影響

以蛋白及多糖的得率為指標，精密稱取麻蛇子粉1.000 0 g，在固定料液比1：20、pH=9、溫度40 ℃的條件下，提取兩次，將兩次麻蛇子粉上清液混合在100 mL 容量瓶中，吸取少許上清液，按2.1.4和2.2.3項下的方法，分別測出麻蛇子粉中蛋白質(zhì)和多糖的含量，改變超聲時間，考察不同超聲時間（30、40、50、60、70、80、90 min）對蛋白質(zhì)和多糖得率的影響。

2.4.2 ?pH對蛋白和多糖得率的影響

以蛋白質(zhì)和多糖得率為指標，精密稱取麻蛇子粉1.000 g，在固定料液比1：20、超聲時間50 min、溫度40 ℃的條件下，提取兩次，將兩次麻蛇子粉上清液混合在100 mL 容量瓶中，吸取少許上清液，按2.1.4和2.2.3項下的方法，分別測出麻蛇子粉中蛋白質(zhì)和多糖的含量，改變提取時的pH值，考察不同pH（7、8、9、10、11、12）對蛋白及多糖得率的影響。

2.4.3 ?料液比對蛋白和多糖得率的影響

以蛋白質(zhì)和多糖為指標，精密稱取麻蛇子粉1.000 0 g，在固定超聲時間50 min，pH=9，溫度40 ℃的條件下，提取兩次，將兩次麻蛇子粉上清液混合在100 mL 容量瓶中，吸取少許上清液，按2.1.4和2.2.3項下的方法，分別測出麻蛇子粉中蛋白質(zhì)和多糖的含量，改變提取的料液比，考察不同料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL）對蛋白質(zhì)和多糖提取率的影響。

2.5 ?數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用Excel進行數(shù)據(jù)處理，然后用SPSS19.0進行方差分析。

3 ?結(jié)果與分析

3.1 ?蛋白質(zhì)標準曲線

牛血清蛋白標準溶液在吸光度線性范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，回歸方程為：

3.2 ?多糖標準曲線

葡萄糖標準溶液在吸光度線性范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，線性回歸方程：

3.3 ?單因素實驗

3.3.1 ?超聲時間對蛋白和多糖得率的影響

由圖1可知，在30～90 min的時間段內(nèi)，多糖和蛋白出現(xiàn)先升高后減少然后緩慢升高又減少的趨勢，在30～40 min蛋白質(zhì)的含量顯著升高，可能是因為超聲時間的延長，造成細胞的破壞，有利于蛋白質(zhì)的溶出[6]。40～50 min蛋白質(zhì)的含量減少可能原因是超聲時間的增加，對蛋白質(zhì)也起到一定的破壞作用，繼而使水溶性蛋白質(zhì)降低，50 min后蛋白質(zhì)增長的比較緩慢。多糖先升高后減少，綜合雙指標和經(jīng)濟效益選取30， 40， 50 min進行正交實驗。

3.3.2 ?pH對蛋白和多糖得率的影響

由圖2可知，pH在7～13之間呈現(xiàn)先減少后增長的趨勢，雖然pH在11～13之間顯著增高，但是蛋白質(zhì)在此條件下容易水解破壞，所以綜合蛋白質(zhì)和多糖兩個因素考慮選pH=8～9進行正交工藝的優(yōu)化。

3.3.3 ?料液比對蛋白質(zhì)和多糖得率的影響

由圖3可知，在料液比1∶20到1∶70之間多糖得率一直在減少，可能由于麻蛇子粉中的多糖含量不高，僅需少量的溶劑就可以完全溶出，在料液比1：20到1∶70之間蛋白質(zhì)得率先增加后減少，可能是由于蛋白的含量比較高需要更多的溶劑才可以溶出，綜合考慮，選取料液比為1∶30， 1∶40， 1∶50，進行工藝優(yōu)化。

3.4 ?正交實驗

3.4.1 ?正交工藝評價指標

多糖與蛋白質(zhì)均為麻蛇子粉水提液中主要有效成分，兩者無主次順序，設(shè)定兩者權(quán)重系數(shù)均為1。在提取工藝過程中，先分別計算出多糖和蛋白質(zhì)得率，然后根據(jù)下列公式計算綜合評分[7]方差表明A、B兩因素對麻蛇子粉水提液中的蛋白和多糖影響不顯著，C因素有極顯著的影響。根據(jù)R值極差分析各因素對麻蛇子粉水提液的影響大小為料液比>pH值>超聲時間，綜合考慮經(jīng)濟和得率等因素，最佳工藝為A1B2C2，即超聲時間30 min，pH為9，料液比1：40。在此工藝下進行三次平行實驗，得到綜合評分為1.628 131，多糖得率為0.55%，蛋白質(zhì)得率為12.48%，工藝穩(wěn)定性較好。

4 ?結(jié) 論

回流提取和超聲提取均為傳統(tǒng)的提取方法，回流提取溫度較高，蛋白質(zhì)容易被破壞，超聲提取溫度低，效率高[8，9]。本實驗通過超聲水提的方法，保留了蛋白質(zhì)的活性，又綜合了蛋白質(zhì)和多糖兩個抗腫瘤的有效成分，考察了提取時間，溫度，料液比對麻蛇子粉水提液中蛋白和多糖的影響，在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗，得到在超聲時間30 min，pH為9，料液比為1：40的條件下，蛋白質(zhì)和多糖的提取率最高，且工藝穩(wěn)定性良好，為后續(xù)抗腫瘤活性的研究提供了基礎(chǔ)。

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