張政 孫志藝 王涵琪 王集會 史磊

摘 ?????要：建立了用高效毛細管電泳指紋圖譜法來檢測全蝎酶解液中蛋白類成分（>10 kDa） 的分析方法。采用未涂層彈性熔融石英毛細管柱（93 cm×0.75 μm），有效柱長為79 cm;二極管陣列檢測器;50 mbar壓力進樣10 s;運行電壓為-30 kV;柱溫為20 ℃;運行時間為60 min;考察不同檢測波長、緩沖溶液種類、pH、濃度等對色譜峰的影響，并對10批樣品做了相似度評價。在緩沖溶液濃度為0.2 mol·L-1、pH=5.0硼酸緩沖溶液時響應值較高，譜圖效果最好;檢測波長為220 nm時出峰較多、吸收好，初步建立了以25個峰為共有峰的指紋圖譜。結論：25個峰的高效毛細管電泳指紋圖譜共有模式可以作為全蝎酶解液中蛋白類成分（>10 kDa）的鑒別方法。

關 ?鍵 ?詞：高效毛細管電泳;蛋白;全蝎酶解液

中圖分類號：R 284.2 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）06-1144-05

Abstract： A method of protein detection of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa） by HPCE was established. Elastic-uncoated-fused silica capillary column （93 cm×0.75 μm） with 79 cm effective column length was used as well as diode array detector， the sampling time at 50 mbar was 10 s， the operating voltage was 30 kV， the column temperature was 20 ℃， the operation time was 60 min.The effect of detection wavelength， buffer solution type， pH and concentration on chromatograms was investigated， meanwhile the similarity evaluation of 10 batches of samples was carried out. The results showed that， when 0.2 mol·L-1 borate with pH=5.0 was used as the buffer solution， the response value was higher， and the spectrum was the best. When the detection wavelength was 220 nm， the peak kinds was multiple and the UV absorbance was stronger， and the fingerprint spectrum of 25 peaks was established preliminarily. At last， it's pointed out that common model of HPCE chromatographic fingerprints of the 25 peaks can be used to detect the proteins of scorpion enzymolysis solution （>10 kDa）.

Key words： High performance capillary electrophoresis; Protein; Enzymolysis liquid of scorpion

動物藥是我國傳統(tǒng)中藥中的重要組成部分，具有資源廣、活性強、療效獨特的特點。經過長時間的研究發(fā)現，全蝎酶解液中的粗提混合物在體內對荷瘤小鼠（Lewise肺癌）的抑制率稍弱于西藥對照藥順鉑，而其超濾物蛋白類成分體內抗荷Lewise肺腺癌小鼠的活性強于順鉑常用量的療效[1，2]，這一結果充分地證明全蝎酶解物凍干粉蛋白類成分具有較強的抗肺腺癌的活性，而且主要物質基礎是蛋白多肽類物質，提純物具有更高的藥理活性，很有必要對其進行成份研究。

目前，中藥成分分析的方法有很多，包括：高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和高效毛細管電泳（HPCE）等色譜法[3]。其中，HPLC法最為常用，但用HPLC法進行中藥成分分析有難以避免的缺點，像如分析時間長、分辯率低、色譜柱容易被污染，會嚴重影響分析結果的準確性[4，5]。

毛細管電泳（CE），亦稱高效毛細管電泳（HPCE），是近十幾年來迅速發(fā)展起來的一種分析方法。以是高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間淌度和（或）分配行為上的差異而實現分離的一種液相分配技術[6]。與傳統(tǒng)的電泳技術和現代色譜技術相比，有以下幾個特點：微量、高效、分析速度快、分析對象廣、多模式、經濟、環(huán)保。毛細管電泳具有多種分離模式，有多種功能，應用十分廣泛，通常能配制成溶液或懸浮溶液的樣品均能用CE進行分離和分析[7，8]。毛細管電泳的柱效與分子擴散系數成反比[9，10]，對于擴散系數小、分子量較大的蛋白多肽類物質的分析就有很大的優(yōu)勢，對中藥資源的研究起到了無可替代的推動作用。為了更加精確的研究全蝎酶解液中抗腫瘤的蛋白類成分，特用高效毛細管電泳法來檢測。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

Agilent 3DEC高效毛細管電泳儀，配有二極管陣列檢測器;93 cm（有效柱長為79 cm）×0.75 μm未涂層彈性熔融石英毛細管柱。

1.2 ?試劑

全蝎酶解液凍干粉樣品（分子量>10 kDa）由山東中醫(yī)藥大學化學實驗室自制，硼砂，硼酸，磷酸，磷酸二氫鉀，0.1 mol·L-1氫氧化鈉。實驗用試劑均為分析純，實驗用水均為純凈水。

2 ?方法與結果

2.1 ?供試品的制備

精密稱取全蝎酶解液凍干粉（相對分子量>10 kDa）0.4 g，加6 mL純凈水溶解，于10 mL容量瓶中，加純凈水定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品[11]。

2.2 ?電泳條件

未涂層彈性熔融石英毛細管柱（93 cm×0.75 μm）， 有效柱長為79 cm;二極管陣列檢測器;50 mbar壓力進樣10 s[2]; 運行電壓為-30 kV;柱溫20 ℃[3];供試品用相應的緩沖溶液稀釋一倍。毛細管使用前依次用0.1 mol·L-1氫氧化鈉、純凈水沖洗毛細管 5 min， 再用緩沖液沖洗至基線平穩(wěn)后開始進樣，每兩次進樣之間設定緩沖液沖洗 5 min[12-14]。上述試劑使用前均用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3 ?單因素考察

2.3.1 ?檢測波長確定[4]

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;pH 5.0條件下，分別在波長220、245、280 nm進行測定，記錄并分析不同波長條件下的色譜圖，見圖1。

結果顯示，在檢測波長為220 nm時吸收峰較多，強度適宜。故選將檢測波長設為220 nm。

2.3.2 ?緩沖溶液種類的確定

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在檢測波長為220 nm;pH=5.0條件下，分別選用硼砂緩沖溶液[4]、硼酸緩沖溶液[15]、磷酸緩沖溶液[16]進樣分析，觀察色譜峰情況，見圖2。

由圖2可知，緩沖溶液為硼砂緩沖溶液時，色譜峰很少，強度很低;為磷酸緩沖溶液時，不出峰;為硼酸緩沖溶液時，色譜峰數目比前幾種緩沖液要多，峰強度適宜。因此分析選擇硼酸緩沖溶液比較好。

2.3.3 ?緩沖溶液濃度的確定

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在檢測波長220 nm;pH=5.0條件下，在選定硼酸緩沖溶液后，考察了不同緩沖液濃度（0.1、0.2、0.3 mol·L-1）對分離度的影響，見圖3。

由圖3可知，隨著緩沖溶液濃度增加，色譜峰強度減弱，分析時間延長。綜合譜圖分析，選擇0.2 mol·L-1硼酸緩沖溶液色譜峰形最好。

Fig.3 A （0.1 mol·L-1 boric acid buffer solution）， B （0.2 mol·L-1 boric acid buffer solution）， C （0.3 mol·L-1 boric acid buffer solution）

2.3.4 ?緩沖溶液pH的確定[4]

按照本實驗2.2中的固定電泳條件，在0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;檢測波長220 nm條件下，本實驗考察了pH=5.5、5.0、4.5不同pH時的分離狀況，見圖4。

由圖4可知，pH=5.5，出峰數目最少;pH=4.5次之;pH=5.0時最好。綜合譜圖分析，選擇pH=5.0時色譜峰峰形，分離效果最好。

2.4 ?方法學考察[10，11，17]

2.4.1 ?穩(wěn)定性實驗

一份供試品配置后0、2、6、10、24 h按照本實驗所選的最優(yōu)實驗條件進樣分析，選擇10號峰為參比峰，結果樣品在24 h內，共有峰的相對遷移時間RSD<2.021%，相對峰面積RSD<3.001%，表明供試品在測定的24 h穩(wěn)定。

2.4.2 ?精密度實驗

取同一試樣，按照本實驗所選擇的最優(yōu)實驗條件進樣分析6次，選擇10號峰為參比峰，計算共有峰的相對遷移時間RSD<2.217%，相對峰面積RSD<4.980%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 ?重現性實驗

取6份全蝎酶解凍干粉，按照本實驗所選的最優(yōu)實驗條件進樣分析，選擇10號峰為參比峰，計算各峰的相對遷移時間、相對峰面積，計算RSD，計算出各峰的相對遷移時間RSD<2.972%，相對峰面積RSD<4.641%，證明本實驗方法重現性好。

2.5 ?指紋圖譜的建立[18，19]

根據十批次樣品測定結果給出的峰數、峰面積和峰位（相對遷移時間）等相關參數進行系統(tǒng)的比較，確定優(yōu)化的指紋圖譜，見圖5。

2.6 ?指紋圖譜分析

2.6.1 ?共有指紋圖譜的標定

2.6.2 ?相似度評價

取十批次已溶解的供試品于樣品管中，按照本實驗所選擇的最優(yōu)實驗條件進樣分析。比較十批次供試品的色譜圖，應用EXCEL表格，對十批次進樣數據分析，形成對照譜圖，見圖6。

經共有模式譜圖計算相似度。見表1。

表1表明，本實驗10批次進樣得到譜圖的相似度都在0.999左右，證明本實驗10批次進樣得到的譜圖相似度好。

3 ?討 論

本實驗重點研究了緩沖溶液對于分離的影響。本實驗研究表明，采用在2.2中固有的實驗條件下，采用檢測波長220 nm;0.2 mol·L-1的硼酸緩沖溶液;pH=5.0時對全蝎酶解液蛋白類成分檢測效果好，由本實驗獲得的高效毛細管電泳指紋圖譜可以作為全蝎酶解液蛋白類成分（相對分子量>10 kDa）定性或定量的依據。

毛細管電泳技術的研究與應用，為藥物分析、藥物研究等領域帶來了生機與活力，尤其是在中成藥復方制劑的分析研究、中藥材種屬的鑒定和基因工程藥物研究方面的進展迅速[3，4]，令人矚目。

但毛細管電泳法也有難以完全改善的缺點。例如，毛細管柱內徑很小，蛋白質易于吸附堵塞，另外雖然通過改變緩沖溶液可以減少蛋白質的吸附，但由于毛細管電泳分離模式的多樣性，蛋白質吸附問題仍是亟待解決的問題之一。再有與HPLC相比，高效毛細管電泳存在重現性差的問題，雖然選擇了比較優(yōu)的實驗條件，但實驗結果對于蛋白質的定量分析遠不如高效液相色譜法簡便、重現性高。由于蛋白的相對分子質量大，不同蛋白的等電點也不相同，pH值改變，相對應的蛋白的電泳方向可能也會發(fā)生改變，所以高效毛細管電泳法在目前來說并不是最優(yōu)的蛋白定量方法。

雖然如此，毛細管電泳技術在中藥復方制劑研究中仍發(fā)揮著重要的作用，隨著科技的不斷發(fā)展，相信毛細管電泳技術應用將會更加廣泛。

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