劉曉梅　梁長東　李景芳　楊和川　任立凱

摘要 [目的] 明確微生物發(fā)酵液對灰霉病菌的防治作用。[方法]通過室內毒力測定和田間藥效試驗研究了微生物發(fā)酵液對灰霉病菌的抑制作用和田間防效。[結果]毒力測定結果表明，微生物發(fā)酵液能明顯抑制灰霉病菌菌絲的生長，發(fā)酵液原液的抑制率最高為66.18%。田間試驗結果表明，對番茄間隔7 d、連續(xù)施藥3次，第3次施藥7 d后，微生物發(fā)酵液原液對灰霉病的防效最高達60.47%，與35%的腐霉利600倍液的防治效果無顯著差異。[結論]微生物發(fā)酵液對番茄灰霉病有較好的防治效果，其作為一種生物新型殺菌劑值得進一步研究、開發(fā)和利用。

關鍵詞 微生物發(fā)酵液;灰霉菌;防治效果

中圖分類號 S436.412.1+3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0145-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.043

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Control Effects of Microbial Fermentation Liquid on Tomato Gray Mould in Protected Field

LIU Xiaomei，LIANG Changdong，LI Jingfang? et al

（Lianyungang Academy of Agricultural Sciences， Lianyungang，Jiangsu? 222000 ）

Abstract [Objective] To study the effect of microbial fermentation liquid on controlling gray mould. [Method] Toxicity experiments and field trials were conducted. [Result] Toxicity experiments showed that the microbial fermentation liquid could significantly inhibit the growth of Botrytis cinerea， and the inhibition rate of the fermentation liquid was 66.18%. In the field trials， the control effect of microbial fermentation liquid on grey mold was 60.47% 7 days after the third treatment， which was no significant difference from the control effect of 600fold dilution of 35% saprophytic. [Conclusion] The microbial fermentation liquid had control effect on tomato Botrytis cinerea， as a new biological fungicide， it was worthy of further research， development and utilization.

Key words Microbial fermentation liquid;Tomato gray mould;Control effect

基金項目 連云港市財政專項（QNJJ1719）。

作者簡介 劉曉梅（1987—），女，河南偃師人，助理研究員，碩士，從事植物保護研究。 通信作者，副教授，從事作物栽培及資源與壞境研究。

收稿日期 2019-07-17

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的真菌性氣傳病害。近年來隨著保護地番茄種植面積的不斷增加，灰霉病菌在土壤中大量累積，特別是在冬春季節(jié)最容易發(fā)生，且常暴發(fā)式擴增，嚴重影響番茄的產量和品質[1]，給農業(yè)生產帶來巨大損失[2]。目前，保護地番茄灰霉病防治主要以化學藥劑[3-4]為主，然而化學農藥的長期施用往往會造成灰霉病菌的抗藥性增加，且防治效果逐步降低[5-7]，另外還會導致病害的流行[8]。同時，化學農藥殘留問題比較嚴重，且越來越引起人們的關注，尤其是對鮮食果蔬，給環(huán)境及人畜健康帶來嚴重威脅[9]。因此，探索生物新型殺菌劑來替代常規(guī)化學農藥對保護地蔬菜種植具有積極的影響。

連云港市農業(yè)科學院資源與環(huán)境研究室制備的微生物發(fā)酵液是利用納豆芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌進行發(fā)酵，而這3種微生物對多種病原菌均具有良好的殺菌效果，目前已有大量研究[10-18]，但其混合發(fā)酵液的殺菌作用效果還不明確。筆者通過室內毒力測定及田間藥效試驗進一步證實該微生物發(fā)酵液對保護地番茄灰霉病的殺菌效果，旨在為新型高效生物殺菌劑的開發(fā)和應用提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試番茄。番茄品種為中蔬四號，購于中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所。

1.1.2 供試藥劑。微生物發(fā)酵液由連云港市農業(yè)科學院資源與環(huán)境研究室提供，35%腐霉利懸浮劑購于四川宜賓川安高科農藥有限公司。

1.1.3 病原菌。灰葡萄孢（Botrytis cinerea）斜面購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

1.1.4 PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B1 10 mg，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 灰葡萄孢斜面轉接。

從灰葡萄孢斜面取0.5 cm×0.5 cm正方形菌塊接種在PDA平板培養(yǎng)基上，正置放入培養(yǎng)箱，25～28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長滿平板保存待用。

1.2.2 微生物發(fā)酵液對灰霉病菌菌絲生長抑制作用的測定。

采用生長速率法測定。將PDA培養(yǎng)基熔化，待冷卻至45～50 ℃時，在無菌操作條件下倒入滅菌培養(yǎng)皿中，每皿10～15 mL培養(yǎng)基，搖勻后冷卻凝固。將微生物發(fā)酵液配成不同濃度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀釋），以化學試劑腐霉利和清水作對照。取消毒燒杯，標記藥劑名稱及濃度，分別盛取藥液，再用滅菌鑷子夾取消毒濾紙片（直徑4～5 mm）分別投入藥液中，然后把浸透的濾紙片按順序列于距培養(yǎng)基中央2.3 cm處，每皿放4片，并在培養(yǎng)皿底面加標簽。夾取濾紙片時應在燒杯壁上停留片刻，讓多余的藥液流去。最后將 PDA 平板上培養(yǎng)7 d的灰葡萄孢霉打成直徑 6 mm的菌餅，接種于 PDA 培養(yǎng)皿中央。每個處理5次重復。置于25 ℃左右恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

抑制百分率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%

1.2.3 微生物發(fā)酵液對番茄灰霉病菌田間防治效果測定。

1.2.3.1 試驗設計。

將微生物發(fā)酵液配成不同濃度（原液、5倍、10倍、20倍、40倍稀釋），以腐霉利和清水作對照，選取長勢一致3葉1心的植株幼苗作處理，每個處理20株，共3個重復。

1.2.3.2 施藥時間與方法。

2019年1月3日第1次噴藥，1月10日和1月17日進行第2、3次施藥，共3次，采用小噴壺進行噴灑番茄植株葉正反面，做到濕而不滴。

1.2.3.3 調查方法和分級標準。

發(fā)病初期噴藥前進行病情調查，每次施藥后7 d調查病害情況。每小區(qū)5點取樣，每點取5株，每株調查所有葉片上病斑面積占整株葉片的百分比進行分級。按以下[19]標準進行病害分級。根據病害調查結果計算病情指數(shù)和防治效果。數(shù)據采用鄧肯氏新復極差法（DMRT）進行統(tǒng)計分析。

0級：葉片、果實無病;1級：病斑面積占整個葉、果面的5%以下;3級：病斑面積占整個葉、果面的6%～15%;5級：病斑面積占整個葉、果面的16%～25%;7級：病斑面積占整個葉、果面的26%～50%;9級：病斑面積占整個葉、果面的50%以上;

病情指數(shù)=100×[（各級病葉數(shù)×病害級別數(shù)）]/（調查總葉數(shù)×9）

防治效果=[1-（CK0×PT1）/（CK1×PT0）]×100%

式中，CK0為空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù);CK1為空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù);PT0為藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù);PT1為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結果與分析

2.1 微生物發(fā)酵液對番茄灰霉菌菌絲生長的抑制作用

采用生長速率法測定微生物發(fā)酵液對灰霉病菌菌絲生長的抑制作用。結果表明，微生物發(fā)酵液對灰霉病菌菌絲生長具有明顯的抑制作用（表1），且抑制作用隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加而逐步降低，其中發(fā)酵液原液對灰霉病菌菌絲生長的抑制率最高達66.26%，其次是發(fā)酵液5倍稀釋液、10倍稀釋液且之間無顯著差異，20倍、40倍稀釋液抑制作用效果最小。

2.2 微生物發(fā)酵液對保護地番茄灰霉病的田間防治效果

微生物發(fā)酵液對保護地番茄灰霉病的防治效果（表2）表明，在第1次噴施后7 d，微生物發(fā)酵液原液對灰霉病菌的防效最高可達48.24%，與35%腐霉利600倍液藥劑對照、微生物發(fā)酵液5倍稀釋液均無顯著差異;其次是發(fā)酵液10倍稀釋液，防效最低的是20、40倍稀釋液且兩者之間無顯著差異;第2次噴施后7 d，發(fā)酵液原液的防效達58.15%，顯著低于35%腐霉利600倍液藥劑防效72.10%，且顯著高于發(fā)酵液其他稀釋液處理組的防治效果，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加防效逐漸降低，其中5倍與10倍稀釋液，20倍與40倍稀釋液處理之間的防效均無顯著差異;第3次噴施后7 d，微生物發(fā)酵液原液的防治效果達60.47%，顯著高于其他各稀釋倍數(shù)處理，與35%腐霉利600倍液藥劑處理的防治效果無顯著差異。隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加防效逐漸降低，且20倍與40倍稀釋液處理之間的防效均無顯著差異。綜上可知，在3次施藥過程中，微生物發(fā)酵液不同處理組對番茄灰霉病的防治效果逐漸增加，發(fā)酵液原液在第3次噴藥后與藥劑對照無顯著差異。

3 討論

該研究通過生長速率法測定了微生物發(fā)酵液對番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制作用，結果顯示微生物發(fā)酵液能抑制灰霉菌菌絲的生長，其原液的抑制作用效果最好，抑制率為66.18%。在田間藥效試驗中，微生物發(fā)酵液原液在第3次施藥后7 d對番茄灰霉病的防效最高，達60.47%，與35%腐霉利600倍液的藥劑對照之間無顯著差異。綜合上述研究結果可以證實微生物發(fā)酵液對番茄灰霉病具有一定的防治效果。

目前，微生物發(fā)酵液中的納豆芽孢桿菌主要應用在醫(yī)學、保鮮、畜禽水產養(yǎng)殖等方面[20-21]，其發(fā)酵液中殺菌活性物質的研究多集中在次級代謝產物納豆激酶、γ-聚谷氨酸以及一些脂肽類抗菌物質[22-23]。納豆芽孢桿菌在農作物病害防治方面少有研究，而乳酸菌對番茄早疫病菌（Alternaria solani）、甜瓜疫霉菌（Phytophthora drechsleri Tucker）、蘋果炭疽?。℅lomer ellacingulated）、灰葡萄孢霉菌（Botrytis cinerea）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的抑制作用已有人研究[11，24]。酵母菌被作為一種生防菌具有適應力強、定殖快、不產生抗菌素等優(yōu)勢。目前利用酵母菌來防治植物病害主要集中在果蔬采后病害的控制[15，17]。研究證明酵母菌可誘導番茄果實中防御相關酶活性增強番茄對灰霉病抗病能力[25]。由此看來，納豆芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌混合微生物發(fā)酵液在農業(yè)殺菌劑的開發(fā)利用方面具有很大潛力，且作用范圍較廣。雖然，目前納豆芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌這3種微生物各自的殺菌作用已有不少研究，但其混合發(fā)酵液的殺菌作用還很少有研究，且對于鮮食果蔬病害防治方面具有較高的研究價值。該試驗證實了該微生物發(fā)酵液對灰霉病菌的殺菌效果，但其殺菌作用方式及對其他病原菌的殺菌作用效果還有待進一步研究。

47卷21期劉曉梅等 微生物發(fā)酵液對保護地番茄灰霉菌的抑制作用效果評價

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