榮松柏　李強生　初明光

摘要 通過人工接種的方法研究來自不同地區(qū)30份菌株的致病力（性）。結(jié)果表明，不同菌株間致病力存在差異，病情等級為1.92～8.84，以強致病力為主，占比73.3%。不同寄主對菌株的抗感反應(yīng)也存在差異，可為病原菌菌群劃分和育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 油菜黑脛病;病原菌;致病力;人工接種;差異

中圖分類號 S436.24文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0136-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.040

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Analysis of Pathogenicity Differentiation of Leptosphaeria biglobosa in Brassica napus

RONG Songbai， LI Qiangsheng， CHU Mingguang

（Crop Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui?? 230031）

Abstract The pathogenicity of 30 isolates from different regions was identified by artificial inoculation in this study. The result showed the pathogenic varieties were obvious among the isolates， ranging from 1.92 to 8.84. The isolates with more aggressive pathogenicity were dominant， accounting for 73.3% in the experiment. The pathogenicity of the differential races was various， which provided a theoretical basis for the classification and breeding of pathogenic.

Key words Leptosphaeria biglobosa;Pathogenic bacteria;Pathogenicity;Artificial inoculation;Differentiation

基金項目 國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0100602）;院自主創(chuàng)新基金項目（17A0206）。

作者簡介 榮松柏（1978—），男，安徽樅陽人，副研究員，碩士，從事油菜抗病育種研究。通信作者，博士研究生，研究方向：油菜抗病育種。

收稿日期 2019-09-03

油菜黑脛?。╬homa stem canker）是世界性油菜真菌病害之一[1]，在加拿大、澳大利亞和歐洲很多國家都有大面積發(fā)生[2]。該病害有強侵染型菌（Leptosphaeria maculans）和弱侵染型菌（L.biglobosa）2種類型[3]。在致病性上前者強于后者，也是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)油菜黑脛病害流行及危害的主要病原菌，據(jù)統(tǒng)計每年造成全球油菜經(jīng)濟損失約9億美元[2]。研究者根據(jù)接種寄主對不同菌株抗感反應(yīng)以及菌株致病性的差異，將L.maculans菌進行了菌群的劃分[4-5];隨著分子生物學(xué)的發(fā)展利用，完成了基因?qū)虻牟≡硇》N和抗性資源的研究[6-7]。 L.biglobosa在我國已普遍發(fā)生[8-9]，通過人工接種和田間自然誘導(dǎo)接種，已證明了L.biglobosa菌對油菜

產(chǎn)量及相關(guān)性狀具有一定的影響[10]。但在病原菌類型、致病性等研究上較少。筆者從全國不同地區(qū)采集30份菌株，利用人工接種的方法研究其致病性差異，以期為研究病害菌群以及抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與品種

供試菌株為2009—2015年在全國油菜種植區(qū)采集的病株（表1），經(jīng)實驗室內(nèi)分離、純化和分子生物學(xué)PCR鑒定。菌株置于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)備用。供試油菜品種10個，均由安徽省農(nóng)業(yè)科院作物研究所提供，其中國外品種5個，十字花科白菜品種1個（表2）。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化、孢子懸浮液配制。

切取邊長約0.2 cm的病斑秸稈組織，經(jīng)消毒、清洗等處理后置水瓊脂培養(yǎng)基上，20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3～5 d，再挑取少量菌絲體在PDA上培養(yǎng)，反復(fù)多次，直至純化[11]。無菌條件下挑取少量純化后的菌絲在V8果汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d。產(chǎn)生孢子后用無菌水稀釋，配制成濃度為107/mL分生孢子懸浮液[12-13]。

1.2.2 DNA提取和PCR 鑒定。

用干凈的刀片從長滿菌絲的培養(yǎng)皿（Φ為90 mm）中輕輕刮下菌絲，利用真菌DNA快速提取試劑盒（上海生工B518229）按照試劑盒操作說明提取DNA。

多重PCR引物從上海生物工程公司定購，由于病原菌有2種類型，引物A：5-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3用于鑒定L.maculans，引物B：5-ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3用于鑒定 L.biglobosa， 引物 R：5-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3為共同反向引物。20 μL PCR反應(yīng)體系：40 ng DNA模 板，正向引物各100 ng，反 向 引 物 200 ng，4 μmol dNTPs，1U的Taq酶，30 mmol MgCl2，1倍PCR緩沖液，加ddH2O調(diào)至反應(yīng)體積。引物PCR反應(yīng)為常規(guī)SCAR反應(yīng)程序，65 ℃退火。

[6] ROUXEL T，BALESDENT M H.The stem canker（blackleg）fungus，Leptosphaeria maculans，enters the genomic era[J].Mol Plant Pathol，2005，6（3）：225-241.

[7] VAN DE WOUW A P，LOWE R G T，ELLIOTT C E，et al.An avirulence gene，AvrLmJ1，from the blackleg fungus，Leptosphaeria maculans，confers avirulence to Brassica juncea cultivars[J].Mol Plant Pathol，2014，15（5）：523-530.

[8] WEST J S，EVANS N，LIU S Y，et al.Leptosphaeria maculans causing stem canker of oilseed rape in China[J].Plant pathology，2000，49（6）：800.

[9] 李強生，榮松柏，胡寶成，等.中國油菜黑脛病害分布及病原菌鑒定[J].中國油料作物學(xué)報，2013，35（4）：415-423.

[10] 榮松柏，胡寶成，陳鳳祥，等.油菜黑脛病對油菜產(chǎn)量及農(nóng)藝性狀的影響[J].作物雜志，2015（6）：159-161.

[11] 陶煉.農(nóng)作物病害研究之油菜黑脛病害[M].北京：光明日報出版社，2009.

[12] MENGISTU A，RIMMER R S，WILLIAMAS P H.Protocols for in vitro sporulation，ascospore release，sexual mating，and fertility in crosses of Leptosphaeria maculans[J].Plant disease，1993，77（5）：538-540.

[13] LI H，BARBETTI M J，SIVASITHAMPARAM K.Concomitant inoculation of an avirulent strain of Leptosphaeria maculans prevents breakdown of a single dominant genebased resistance in Brassica napus cv.Surpass 400 by a virulent strain[J].Field crops research，2006，95（2/3）：206-211.

[14] WILLIAMS P H，DELWICHE P A.Screening for resistance to blackleg of crucifers in the seeding stange[C]//VAN MERREWIJK N P A，TOXOPEUS H.Proceeding of the Eucarpia Cruciferae Conference.Wageningen，Netherlands：[s.n]，1979：164-170.

[15] 胡寶成.把論文寫在大地上：參加國家油菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系工作紀實[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2017.