姜 楠，王劉慶，李祖梁，王 多，王 蒙,*

（1.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京），農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測(cè)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

交鏈孢菌（Alternariaspp.）是污染農(nóng)產(chǎn)品及其制品最普遍的真菌之一，廣泛分布于自然界，其中互隔交鏈孢（Alternaria alternata）是主要的病原菌，其不僅能夠侵染多種農(nóng)作物，引起植物病害（如番茄黑斑病等），而且能夠產(chǎn)生交鏈孢毒素。檢出率較高的交鏈孢毒素包括細(xì)交鏈孢酮酸（tenuazonic acid，TeA）、交鏈孢酚（alternariol，AOH）、交鏈孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）等[1-3]。交鏈孢毒素對(duì)動(dòng)植物具有一定的潛在危害，其中AOH具有遺傳毒性和致突變性，還可促使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[4-6]。TeA與AOH、AME具有協(xié)同作用，且均具有動(dòng)物急性毒性[7]。歐洲食品安全局的數(shù)據(jù)顯示隨膳食攝入的AOH對(duì)公眾健康存在風(fēng)險(xiǎn)[8-10]，研究顯示河南省林縣地區(qū)食管癌高發(fā)可能與糧食作物中交鏈孢毒素污染，特別是AOH及其甲基化產(chǎn)物AME含量較高有關(guān)[11-12]。目前食品中的交鏈孢毒素污染已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因此掌握有效抑制交鏈孢菌生長(zhǎng)及其產(chǎn)毒的防控方法具有重要意義。

臭氧作為強(qiáng)氧化劑，可迅速破壞有機(jī)物中的雙鍵，形成含雙鍵少、分子質(zhì)量較低的物質(zhì)；且低劑量臭氧作用于糧食、果蔬等農(nóng)產(chǎn)品表面即可起到殺菌消毒的作用[13]。臭氧可自動(dòng)分解為氧氣，無(wú)毒性殘留，早在1997年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局就將臭氧作為一種普遍認(rèn)為安全的方法應(yīng)用于食品加工過(guò)程中，目前臭氧已在食品加工貯藏、果蔬保鮮、廢水處理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[14]。臭氧處理還可以殺滅真菌、有效破壞毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)降解毒素的目的。近年來(lái)，臭氧用于防控產(chǎn)毒真菌、降解真菌毒素的研究多有報(bào)道。Mylona等研究發(fā)現(xiàn)臭氧氣體不僅在體外可抑制輪枝鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)，同時(shí)可抑制在玉米粉中伏馬毒素（fumonisin B，F(xiàn)B）的積累[15]。Savi等的研究表明臭氧處理可以抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，同時(shí)可有效降解小麥粒中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）[16]。此外，還有研究報(bào)道臭氧用于降解花生及紅辣椒中的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）[17-18]、蘋果汁中的展青霉素[19]、玉米中的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）以及赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）[20]等。一些臭氧對(duì)互隔交鏈孢影響的研究也表明臭氧處理可抑制互隔交鏈孢的孢子萌發(fā)及菌絲生物量生長(zhǎng)[21-22]。然而，鮮見(jiàn)臭氧處理拮抗交鏈孢產(chǎn)毒以及其直接降解毒素的研究。鑒于此，本研究不僅考察不同劑量的臭氧處理對(duì)體外互隔交鏈孢生長(zhǎng)及產(chǎn)毒能力的影響；而且通過(guò)接種番茄研究臭氧處理后互隔交鏈孢在番茄活體內(nèi)的致病能力及產(chǎn)毒情況，同時(shí)分析了臭氧對(duì)交鏈孢毒素的直接降解效果，以期為利用臭氧防控互隔交鏈孢侵染及其毒素積累提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅熟番茄（Solanum lycopersicumcv. Shengfan15）采于北京天安農(nóng)業(yè)有限公司的番茄園，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，選擇大小均一、同一成熟度、果形端正、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲害的番茄果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)用果。將番茄果實(shí)經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉溶液浸泡1 min，隨后沖洗，自然晾干備用。

交鏈孢毒素標(biāo)準(zhǔn)品（AOH、AME、TeA）（純度均大于99%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（均為質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Fisher公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA） 美國(guó)Becton公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTM超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀、電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；3-30k臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；N-EVA-112P氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；A11分析研磨機(jī)、漩渦混合器 德國(guó)IKA公司；Milli-Q A10超純水器 美國(guó)Millipore公司；QJ-8006K臭氧發(fā)生器 廣州銓聚臭氧科技有限公司；APES-O3臭氧檢測(cè)儀 深圳安帕爾科技有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 互隔交鏈孢培養(yǎng)及孢子懸浮液配制

本研究所用的互隔交鏈孢為本實(shí)驗(yàn)室前期從番茄上分離純化得到的菌株，將互隔交鏈孢接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)10 d。然后用體積分?jǐn)?shù)為0.05%的Tween-80溶液沖洗平板，采用血球計(jì)數(shù)板法制成濃度約為1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 臭氧處理互隔交鏈孢孢子懸浮液

參考文獻(xiàn)[23]的方法并有所修改。分別吸取2 mL交鏈孢菌孢子懸浮液置于25 mL小燒杯中（燒杯直徑為5 cm），將裝有孢子懸浮液的小燒杯放入已消毒的密閉貯藏箱（48 cm×28 cm×28 cm）中，同時(shí)將臭氧檢測(cè)器置于貯藏箱中，在室溫條件下通入臭氧氣體，控制臭氧發(fā)生器使箱內(nèi)臭氧質(zhì)量濃度分別為5、10、20 mg/L，處理30 min。處理結(jié)束后回收燒杯內(nèi)的孢子懸浮液，以不經(jīng)臭氧處理的孢子懸浮液作為對(duì)照，分別接種于PDA培養(yǎng)基及番茄果實(shí)上。

接種PDA培養(yǎng)基：分別吸取對(duì)照及不同質(zhì)量濃度臭氧處理后的交鏈孢菌孢子懸浮液20 μL接種于PDA平板上，25 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)7 d，每組接種5 個(gè)平板，分別于第3、5、7天用游標(biāo)卡尺十字交叉測(cè)量菌落直徑，并于第7天取1/4培養(yǎng)基進(jìn)行交鏈孢毒素的提取及測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

接種番茄果實(shí)：接種前用直徑3 mm、已滅菌的不銹鋼釘子在番茄赤道部位刺入1 個(gè)傷口（3 mm×3 mm），待傷口表面晾干后分別吸取對(duì)照及不同質(zhì)量濃度臭氧處理后的交鏈孢菌孢子懸浮液20 μL接種于番茄果實(shí)上，每組設(shè)置15 個(gè)番茄，接種后放置在室溫為20 ℃的環(huán)境中貯藏7 d，分別于第3、5、7天用游標(biāo)卡尺十字交叉測(cè)量病斑部位的直徑，并于第7天在病斑部位處取樣。將病斑部位樣品用研磨機(jī)混合勻漿，貯存于－20 ℃待測(cè)定交鏈孢毒素含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2.2 臭氧處理交鏈孢毒素標(biāo)準(zhǔn)品

參考文獻(xiàn)[14]的方法并有所修改。將TeA、AOH、AME 3 種交鏈孢毒素標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL小燒杯中（燒杯直徑為5 cm）。將裝有毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的小燒杯放入已消毒的密閉貯藏箱（48 cm×28 cm×28 cm）中，同時(shí)將臭氧檢測(cè)器置于貯藏箱中，在室溫條件下通入臭氧氣體，控制臭氧發(fā)生器使箱內(nèi)臭氧質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、40 mg/L，處理30 min；另外，固定臭氧質(zhì)量濃度為20 mg/L，分別處理毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液15、30、45、60、90、120 min。處理結(jié)束后，回收燒杯內(nèi)的毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用UPLC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，以不經(jīng)臭氧處理的毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，考察不同臭氧質(zhì)量濃度及處理時(shí)間對(duì)交鏈孢毒素的降解作用。臭氧處理交鏈孢毒素降解率按下式計(jì)算。

式中：c（A,t）為交鏈孢毒素經(jīng)臭氧處理時(shí)間t后的含量/（μg/kg）；c（A,0）為交鏈孢毒素的初始含量/（μg/kg）。

1.3.3 掃描電子顯微鏡觀察互隔交鏈孢的微觀形態(tài)

參考文獻(xiàn)[24]的方法并有所修改。為進(jìn)一步研究臭氧對(duì)互隔交鏈孢孢子和菌絲形態(tài)的影響，對(duì)其進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。選擇10、20 mg/L臭氧處理后的孢子懸浮液接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下恒溫避光培養(yǎng)24 h后在菌落周圍插入滅菌的玻璃片，培養(yǎng)24 h后取出玻璃片。將長(zhǎng)有交鏈孢菌的玻璃片置于戊二醛溶液中固定2～12 h，用0.1 mol/L pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗2 次，每次10 min；依次用體積分?jǐn)?shù)20%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液梯度洗脫，每次15 min，再用無(wú)水乙醇洗脫2 次，每次15 min；最后用叔丁醇置換，每次30 min，共置換3 次，最后一次置于4 ℃冰箱里，待叔丁醇凝固后冷凍干燥，隨后進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，以不經(jīng)臭氧處理組為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 交鏈孢毒素含量的測(cè)定

交鏈孢毒素的提取及含量測(cè)定參考本課題組前期研究的方法[25]，并略有修改。取番茄病斑樣品（5 g）及1/4 PDA培養(yǎng)基樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入20 mL含有體積分?jǐn)?shù)1%甲酸的乙腈溶液，漩渦混勻，經(jīng)150 r/min常溫振蕩提取30 min，漩渦振蕩后經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心（1 000 r/min、10 min、10 ℃），離心完成后取1 mL上清液于40～50 ℃條件下氮?dú)獯抵两?，隨后用1 mL乙腈溶液（體積比3∶7）復(fù)溶，混勻后過(guò)0.22 μm PTFE微孔濾膜，經(jīng)UPLC-MS/MS測(cè)定，每個(gè)樣品設(shè)定3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)的方差分析及多重比較均采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行，用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），采用Gaphpad prism軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢菌落直徑的抑制

表1所示為臭氧處理互隔交鏈孢孢子懸浮液后接種到PDA培養(yǎng)基上，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不同臭氧質(zhì)量濃度處理對(duì)互隔交鏈孢菌落直徑的抑制情況。從表1可以看出，臭氧氣體對(duì)互隔交鏈孢菌絲的生長(zhǎng)有較大程度的延緩和抑制作用，處理組的菌落比對(duì)照組生長(zhǎng)顯著減慢（P＜0.05）。同時(shí)可以看出，抑制作用與臭氧質(zhì)量濃度有關(guān)，隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)互隔交鏈孢菌落直徑的抑制作用明顯加強(qiáng)，互隔交鏈孢菌絲生物量積累逐漸減小。在培養(yǎng)第7天，對(duì)照組的菌落直徑為6.88 cm，此時(shí)臭氧質(zhì)量濃度為10 mg/L的處理組菌落直徑為5.58 cm，臭氧質(zhì)量濃度為20 mg/L的處理組菌落直徑僅為5.10 cm，顯著低于對(duì)照組及低質(zhì)量濃度的臭氧處理組（P＜0.05），其對(duì)互隔交鏈孢生長(zhǎng)的抑制率分別為18.9%和25.9%。

表 1 臭氧處理對(duì)交鏈孢菌生長(zhǎng)的抑制情況Table 1 Inhibitory effect of ozone on mycelial growth of A. alternata

臭氧直接作用于互隔交鏈孢孢子懸浮液，導(dǎo)致其生長(zhǎng)受到抑制，這可能是因?yàn)槌粞醯膹?qiáng)氧化作用直接使分生孢子失活，使其完全喪失萌發(fā)能力；或者臭氧破壞了分生孢子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而使健康的分生孢子數(shù)量減小，進(jìn)而導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)緩慢。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，Ames等[21]將互隔交鏈孢長(zhǎng)期置于低含量臭氧氣體（150 nL/L）中，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，互隔交鏈孢的菌落直徑生長(zhǎng)逐漸減慢、分生孢子數(shù)量逐漸減小，在100 d時(shí)分生孢子全部失活。Tzortzakis等也研究了不同濃度的臭氧熏蒸對(duì)交鏈孢菌的菌絲生物量及分生孢子的影響，結(jié)果表明臭氧處理后互隔交鏈孢的菌絲生物量及分生孢子活力均受到顯著抑制，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加抑制作用顯著增強(qiáng)；同時(shí)，他們指出臭氧對(duì)真菌孢子的抑制作用也與孢子形態(tài)、水分含量、生長(zhǎng)基質(zhì)有關(guān)，具體的抑制機(jī)理還有待研究[22]。

2.2 臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢菌絲及孢子形態(tài)的影響

為了進(jìn)一步考察臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢造成的破壞，采用掃描電子顯微鏡觀察臭氧處理后的互隔交鏈孢菌絲及孢子的形態(tài)變化情況。如圖1所示，與對(duì)照相比，臭氧處理后的互隔交鏈孢形態(tài)發(fā)生異常。正常的互隔交鏈孢孢子呈完整、豐滿的卵形、倒梨形或近似橢球形，表面光滑或具微刺，菌絲表面濃厚光滑，自然伸長(zhǎng)。經(jīng)10 mg/L臭氧處理30 min后互隔交鏈孢孢子發(fā)生很明顯的凹陷、褶皺，菌絲變得干癟、萎縮、粗糙，同時(shí)出現(xiàn)斷裂的情況；臭氧質(zhì)量濃度增大到20 mg/L時(shí)，菌絲和孢子形態(tài)異常程度也逐漸增大，除了明顯的凹陷和褶皺外，孢子表面還發(fā)生破裂，菌絲更加干癟粗糙，且出現(xiàn)不規(guī)則的折疊、皺縮，同時(shí)有些孢子和菌絲表面出現(xiàn)小囊泡，由此可見(jiàn)臭氧對(duì)互隔交鏈孢的菌絲及孢子的破壞作用與臭氧質(zhì)量濃度有關(guān)。

圖 1 掃描電子顯微鏡觀察臭氧處理后互隔交鏈孢的微觀形態(tài)Fig. 1 SEM observation of A. alternata after ozone treatment

當(dāng)真菌暴露在不利于生長(zhǎng)的環(huán)境（如化學(xué)處理、低溫、高濕等）中就會(huì)出現(xiàn)分生孢子減少、菌落生長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象[26-27]。雖然目前尚鮮見(jiàn)臭氧對(duì)互隔交鏈孢形態(tài)學(xué)影響的研究報(bào)道，但Savi等[28]研究了臭氧對(duì)鐮刀菌（Fusarium）、曲霉菌（Aspergillus）以及青霉菌（Penicillium）等真菌形態(tài)學(xué)的影響，以上3 種真菌經(jīng)過(guò)臭氧處理后在形態(tài)上均表現(xiàn)出異常，菌絲出現(xiàn)變形、破裂。郭宇歡等[23]將灰葡萄孢（Botrytis cinerea）暴露于臭氧氣體中，發(fā)現(xiàn)菌絲表面出現(xiàn)溝壑，說(shuō)明臭氧處理對(duì)灰葡萄孢菌絲造成傷害。在本研究中，一方面，臭氧對(duì)互隔交鏈孢的破壞可能是因?yàn)閺?qiáng)氧化作用直接導(dǎo)致大量孢子及菌絲發(fā)生破壞，進(jìn)而引起真菌死亡；另一方面，臭氧的強(qiáng)氧化作用可能使細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、葡聚糖等物質(zhì)發(fā)生化學(xué)作用，改變細(xì)胞壁的完整性，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放，進(jìn)而導(dǎo)致真菌細(xì)胞遭到破壞[29]。

2.3 臭氧處理對(duì)體外互隔交鏈孢產(chǎn)毒能力的影響

圖 2 經(jīng)臭氧處理后互隔交鏈孢在體外PDA培養(yǎng)基上所產(chǎn)毒素含量Fig. 2 Concentrations of various mycotoxins produced by A. alternata with ozone treatment when cultured on PDA plates

不同質(zhì)量濃度臭氧處理互隔交鏈孢孢子懸浮液后接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下避光生長(zhǎng)7 d，第7天進(jìn)行交鏈孢毒素的提取及含量測(cè)定，圖2所示為體外PDA培養(yǎng)基上交鏈孢毒素含量的變化情況。對(duì)照組互隔交鏈孢高產(chǎn)TeA（1.08 mg/cm2），AOH（0.071 mg/cm2）、AME（0.009 mg/cm2）含量相對(duì)較低。本研究結(jié)果表明臭氧處理可顯著抑制A.alternata產(chǎn)TeA、AOH、AME這3 種交鏈孢毒素，且與臭氧質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在低質(zhì)量濃度臭氧（5 mg/L）處理時(shí)，TeA含量為0.88 mg/cm2，AOH含量為0.065 mg/cm2，均低于對(duì)照組，而AME不再產(chǎn)生。隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加，TeA和AOH的含量也逐漸降低，當(dāng)臭氧質(zhì)量濃度增加至20 mg/L時(shí)，TeA含量減少至0.71 mg/cm2，與對(duì)照組相比減少了34.3%；AOH的含量減少至0.033 mg/cm2，比對(duì)照減少了53.5%。

交鏈孢毒素含量的降低可能是因?yàn)榛ジ艚绘滄呓?jīng)臭氧處理后菌絲和孢子受到損傷，導(dǎo)致總的生物量減少，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)生毒素的含量有所降低。目前尚鮮見(jiàn)臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢體外產(chǎn)毒影響的研究，但有臭氧對(duì)其他真菌產(chǎn)毒的文獻(xiàn)報(bào)道。Mylona等[15]將長(zhǎng)有輪枝鐮刀菌的培養(yǎng)基暴露于臭氧氣體中（100×10－6、200×10－6，1 h），10 d后，與對(duì)照相比輪枝鐮刀菌FB產(chǎn)量顯著降低。關(guān)于臭氧能抑制真菌產(chǎn)毒的機(jī)理，有研究認(rèn)為是因?yàn)槌粞踝饔檬拐婢募?xì)胞膜完整性以及參與多種化學(xué)反應(yīng)的酶遭到破壞[30]，而本研究也發(fā)現(xiàn)臭氧能夠有效地破壞互隔交鏈孢細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而減少毒素的合成，然而關(guān)于臭氧抑制互隔交鏈孢產(chǎn)毒的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.4 臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢致病能力及產(chǎn)毒能力的影響

互隔交鏈孢是引起番茄黑斑病的主要病害之一，并且會(huì)在番茄果實(shí)體內(nèi)積累產(chǎn)生交鏈孢毒素，這對(duì)番茄及其加工制品的食用安全造成較大威脅。基于此，本研究選擇番茄為基質(zhì)，將臭氧處理后的互隔交鏈孢接種到健康番茄體內(nèi)，觀察互隔交鏈孢在番茄上生長(zhǎng)的病斑直徑大小以及產(chǎn)毒的變化情況。

表 2 經(jīng)臭氧處理后的交鏈孢菌在番茄上的生長(zhǎng)情況Table 2 Mycelial growth of A. alternata with ozone treatment on tomato fruit

不同質(zhì)量濃度臭氧處理互隔交鏈孢后接種到番茄果實(shí)上，第3、5、7天的病斑直徑如表2所示。隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，互隔交鏈孢病斑直徑逐漸擴(kuò)大，臭氧處理導(dǎo)致病斑延伸較對(duì)照顯著放緩（P＜0.05），且不同質(zhì)量濃度的臭氧處理組之間也表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。隨著臭氧質(zhì)量濃度的增大，互隔交鏈孢在番茄果實(shí)上生長(zhǎng)受抑制程度逐漸增大，說(shuō)明臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢致病力有較明顯的抑制作用，且臭氧質(zhì)量濃度與致病力呈負(fù)相關(guān)。龍君[31]用不同質(zhì)量濃度（50、100、150、200 mg/m3）臭氧氣體熏蒸意大利青霉（Penicillium italicum），隨后接種到柑橘上觀察柑橘的發(fā)病情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明臭氧熏蒸后柑橘青霉菌分生孢子的致病力與對(duì)照組相比有顯著差異，臭氧氣體既能夠抑制柑橘發(fā)病，也能夠延緩病斑的擴(kuò)展。這與本研究結(jié)果類似，臭氧處理組均表現(xiàn)出對(duì)果蔬病原菌的拮抗作用，能夠抑制病害的發(fā)生。

圖 3 臭氧處理后番茄病斑部位的交鏈孢毒素含量Fig. 3 Concentrations of various Alternaria toxins in lesions of tomato fruit inoculated with A. alternata with ozone treatment

圖3所示為臭氧處理后的互隔交鏈孢在番茄果實(shí)上生長(zhǎng)第7天的產(chǎn)毒情況。對(duì)照組互隔交鏈孢在番茄基質(zhì)上產(chǎn)TeA、AOH、AME的含量分別為172.50、3.18、2.22 mg/kg。與對(duì)照組相比，臭氧處理組中3 種交鏈孢毒素的含量均有所下降，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增大，毒素含量顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢產(chǎn)毒能力具有干預(yù)作用，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增大，抑制產(chǎn)毒能力逐漸增強(qiáng)。然而，臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢產(chǎn)3 種毒素的抑制能力有所差異，經(jīng)20 mg/L臭氧處理的番茄果實(shí)貯藏7 d后，TeA的含量為110.2 mg/kg，比對(duì)照組減少了36.1%；而AOH和AME的含量分別為0.32 mg/kg和0.15 mg/kg，分別比對(duì)照組減少了89.9%和93.2%，可見(jiàn)臭氧處理抑制該菌株產(chǎn)AOH和AME毒素的作用更明顯。這說(shuō)明臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢的菌絲和孢子造成破壞，導(dǎo)致其不能在番茄上正常生長(zhǎng)，進(jìn)而引起交鏈孢毒素的積累減少；而不同交鏈孢毒素之間抑制率的明顯差異又顯示出臭氧處理對(duì)互隔交鏈孢產(chǎn)毒的影響不單是緣于對(duì)互隔交鏈孢的抑制，也可能存在其他機(jī)制影響毒素的合成。

番茄果實(shí)富含酚酸，主要有綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、4-羥基苯甲酸等[32]，同時(shí)有研究表明互隔交鏈孢接種到番茄上會(huì)引起酚酸含量的變化，而且體外抑菌實(shí)驗(yàn)也表明綠原酸及咖啡酸對(duì)互隔交鏈孢生長(zhǎng)的抑制率分別是16%、30%[33]。Pane等的研究表明花椒中多酚提取物對(duì)采后互隔交鏈孢侵染櫻桃番茄具有抑制作用[34]。酚酸不僅抑制病原真菌生長(zhǎng)，對(duì)真菌毒素的積累也具有抑制作用，本課題組前期的研究結(jié)果表明，對(duì)香豆酸、咖啡酸可以顯著抑制互隔交鏈孢的生長(zhǎng)及TeA的產(chǎn)生[35]。另外也有研究表明0.5 mmol/L綠原酸及阿魏酸可使輪枝鐮刀菌產(chǎn)T-2毒素分別減少23.1%及26.5%[36]。酚酸是植物防御體系的組成部分，互隔交鏈孢在番茄上的致病力及產(chǎn)毒能力受到抑制可能是由于臭氧和酚酸協(xié)同作用的結(jié)果，但是不同酚酸成分對(duì)交鏈孢毒素的抑制效果及防御機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

2.5 臭氧處理對(duì)交鏈孢毒素的降解作用

圖 4 臭氧處理交鏈孢毒素的降解效果Fig. 4 Degradation of Alternaria toxins by ozone treatment

臭氧因其強(qiáng)氧化作用可以降解真菌毒素或改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其毒性基團(tuán)遭到破壞，從而起到解毒作用。目前眾多研究都表明臭氧對(duì)谷物中的AFB1、OTA、ZEN等具有良好的降解效果，但是對(duì)交鏈孢毒素的降解效果鮮見(jiàn)報(bào)道。圖4為不同臭氧質(zhì)量濃度及處理時(shí)間對(duì)TeA、AOH、AME 3 種交鏈孢毒素的降解效果。從圖4A可以看出，TeA、AOH、AME 3 種交鏈孢毒素的降解率隨臭氧質(zhì)量濃度的增大而逐漸升高，其中TeA經(jīng)20 mg/L臭氧處理30 min后已檢測(cè)不到；AOH在較低臭氧質(zhì)量濃度下降解效果就比較顯著，臭氧質(zhì)量濃度為2 mg/L時(shí)降解率為56.0%，臭氧質(zhì)量濃度增大至40 mg/L時(shí)降解率為75.0%，降解率變化幅度不明顯；而AME在較低臭氧質(zhì)量濃度時(shí)降解效果不明顯，臭氧質(zhì)量濃度增大至40 mg/L時(shí)降解率為63.3%。從圖4B中可以看出，當(dāng)臭氧質(zhì)量濃度固定為20 mg/L時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，交鏈孢毒素的降解率也逐漸增大，對(duì)TeA的降解效果最顯著，在15 min時(shí)降解率達(dá)63.5%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，到30 min時(shí)可被完全降解；AOH在45 min時(shí)降解率為78.8%，在60 min時(shí)降解率為79.5%，在此時(shí)間段降解率變化不顯著，隨著時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，至120 min時(shí)降解率達(dá)91.9%；AME在較短時(shí)間內(nèi)降解效果較差，45 min時(shí)降解率僅為47.6%，長(zhǎng)時(shí)間臭氧處理可較大程度上降解AME，臭氧處理120 min時(shí)其降解率達(dá)到90.0%。

從兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，處理時(shí)間對(duì)3 種交鏈孢毒素降解效率的影響占主導(dǎo)因素，除了TeA在較短時(shí)間就可降解以外，AOH及AME在20 mg/L處理60 min時(shí)降解率即可達(dá)70%以上。與文獻(xiàn)報(bào)道的臭氧處理其他真菌毒素相比，3 種交鏈孢毒素的臭氧處理時(shí)間較長(zhǎng)、所需臭氧質(zhì)量濃度較高。Qi Lijun等[20]研究了不同質(zhì)量濃度臭氧及時(shí)間處理ZEN及OTA的效果，5 mg/L臭氧處理ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液5 s，其降解率超過(guò)90%；10 mg/L臭氧處理OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液10 s，其降解率接近50%。王莉等[14]用質(zhì)量濃度為10 mg/L的臭氧氣體降解DON，結(jié)果表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，DON的降解率也隨之提高，處理5 min后DON降解率達(dá)到88%。由此可見(jiàn)，臭氧質(zhì)量濃度、處理時(shí)間、毒素的初始濃度、水分含量、pH值等因素都會(huì)不同程度地影響臭氧降解真菌毒素的效果[37]。另外，臭氧對(duì)真菌毒素的降解效果也與其結(jié)構(gòu)和特性有關(guān)，臭氧具有強(qiáng)氧化作用，一般會(huì)攻擊雙鍵結(jié)構(gòu)發(fā)生加成反應(yīng)，也可能會(huì)破壞苯環(huán)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為關(guān)于臭氧降解AFB1、DON、ZEN的機(jī)理主要為Criegee機(jī)制[14,38-39]，但是關(guān)于交鏈孢毒素的臭氧降解產(chǎn)物鑒定、降解路徑解析、產(chǎn)物安全性評(píng)價(jià)等方面還需開(kāi)展深入研究。

3 結(jié) 論

臭氧作為一種強(qiáng)效的氧化劑，因其極易分解生成氧氣、無(wú)污染殘留等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品加工貯藏、果蔬保鮮等領(lǐng)域。本研究結(jié)果表明臭氧處理可導(dǎo)致互隔交鏈孢菌絲干癟萎縮和孢子凹陷褶皺，從而導(dǎo)致其在離體時(shí)表現(xiàn)為生長(zhǎng)受到抑制，番茄果實(shí)上表現(xiàn)為致病力減弱，進(jìn)而引起互隔交鏈孢產(chǎn)TeA、AOH、AME 3 種毒素能力的降低。同時(shí)，臭氧處理還能降解3 種交鏈孢毒素，隨臭氧質(zhì)量濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)交鏈孢毒素的降解能力逐漸增加，如TeA經(jīng)過(guò)20 mg/L臭氧處理15 min就可以被大量降解，降解率為63.5%，AOH及AME在20 mg/L時(shí)臭氧處理60 min，降解率可達(dá)70%以上。此外，眾多研究已表明臭氧對(duì)病原真菌的生長(zhǎng)及其毒素積累均具有較強(qiáng)的抑制作用。因此，臭氧技術(shù)可以作為農(nóng)產(chǎn)品及其制品中互隔交鏈孢及其毒素污染的防治手段。本研究初步探索了臭氧技術(shù)對(duì)互隔交鏈孢及其產(chǎn)毒能力的影響，下一步將深入研究臭氧抑制互隔交鏈孢產(chǎn)毒的機(jī)理，鑒定臭氧降解交鏈孢毒素的降解產(chǎn)物，解析降解路徑并評(píng)價(jià)降解產(chǎn)物的安全性，以期為開(kāi)展果蔬貯藏加工過(guò)程中利用臭氧防控交鏈孢毒素污染提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。