劉國榮 郜亞昆 辛夢娜 李雯暉 趙世博 劉 亞 王成濤* 孫寶國

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心北京工商大學(xué) 北京100048 2 天津市和平區(qū)市場監(jiān)督管理局 天津300041 3 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心 昆明650202）

梔子紅色素是一種天然紅色素，是由梔子果實中的京尼平苷經(jīng)脫酯、酸化、β-葡萄糖苷酶水解后生成的京尼平苷酸苷元與伯胺化合物顯色生成[1-2]，易溶于水和30%以下的乙醇水溶液，呈鮮艷紫紅色。現(xiàn)有的梔子紅色素不溶于無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有機試劑和油脂。多名研究學(xué)者對梔子紅色素進行了穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)其對高溫、光均比較穩(wěn)定，而對還原劑穩(wěn)定性較差，易分解褪色，限制了其應(yīng)用[3-4]。目前梔子紅色素在我國尚不允許作為食品添加劑使用，而在歐盟、日本、美國等國家允許使用，在日本有近40年的食用歷史，可廣泛應(yīng)用于飲料、面點、甜酒、餡心、赤豆飯等[5-6]。

化學(xué)改性法是針對色素已有的官能團采用化學(xué)反應(yīng)的方法增加基團，從而改變色素的性質(zhì)，改變色素的溶解性并提高穩(wěn)定性[7-10]。利用化學(xué)改性法可封閉梔子紅色素中的親水基團-OH，降低其分子極性，擴大其溶解范圍。

本研究采用乙酸酐酯化法制備醇溶性梔子紅色素衍生物，利用單因素逐級試驗確定其最佳工藝條件；分析其溶解性和不同條件下的穩(wěn)定性，評價化學(xué)改性法提高擴大梔子紅色素溶解性、穩(wěn)定性的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水溶性梔子紅色素，河南中大生物工程有限公司；乳酸、乙酸酐、濃鹽酸、無水乙醚、無水乙醇、丙酮、石油醚、二甲基亞砜、三氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋁、硫酸銅、氯化鐵、硫酸亞鐵，均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV 2450 型紫外分光光度計，日本島津公司；IKA RCT 基本型磁力攪拌器，德國艾卡公司；pH 400 型臺式pH 計，安萊立思儀器科技有限公司；CM-3610A 型色差儀，日本柯尼卡美能達公司；高速離心機，北京天林恒泰科技有限公司；SHZ-A 水浴恒溫振蕩器，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 梔子紅色素衍生物的制備 稱取適量水溶性梔子紅色素于錐形瓶中，加入一定體積乳酸充分溶解色素，按一定比例加入乙酸酐，加入幾滴濃鹽酸作為催化劑，在一定溫度下勻速攪拌反應(yīng)一定時間，冷卻至室溫，離心取上清（10 000 r/min，10 min），向上清液中加入一定量無水乙醚，離心取沉淀（10 000 r/min，10 min），于40 ℃烘箱中烘干至恒重，得到梔子紅色素衍生物。

1.3.2 梔子紅色素衍生物制備工藝條件的優(yōu)化影響梔子紅色素衍生物制備的主要因素有：料液比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等。以梔子紅色素衍生物的產(chǎn)量為考察指標(biāo)進行單因素逐級試驗，確定影響包合物形成的主要因素。

1.3.2.1 不同料液比對梔子紅色素衍生物產(chǎn)量的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g 水溶性梔子紅色素于錐形瓶中，加入20 mL 乳酸充分溶解，分別加入5，10，15，20，25，30 mL 乙酸酐，加入5 滴濃鹽酸作為催化劑，在室溫（25 ℃）下勻速攪拌反應(yīng)4 h，離心取上清（1 0000 r/min，10 min），向上清液中加入40 mL 無水乙醚，離心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，干燥，稱量。

1.3.2.2 不同反應(yīng)時間對梔子紅色素衍生物產(chǎn)量的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g 水溶性梔子紅色素于錐形瓶中，加入20 mL 乳酸充分溶解，加入20 mL乙酸酐，再加入5 滴濃鹽酸作為催化劑，在室溫（25 ℃） 下分別勻速攪拌反應(yīng)1，2，3，4，5，6 h，離心（10 000 r/min，10 min）取上清，向上清液中加入40 mL 無水乙醚，離心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，干燥，稱量。

1.3.2.3 不同反應(yīng)溫度對梔子紅色素衍生物產(chǎn)量的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g 水溶性梔子紅色素于錐形瓶中，加入20 mL 乳酸充分溶解，加入20 mL乙酸酐，再加入5 滴濃鹽酸作為催化劑，分別在20，30，40，50，60，70，80，90 ℃下勻速攪拌反應(yīng)4 h，離心（10 000 r/min，10 min）取上清，向上清液中加入40 mL 無水乙醚，離心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，干燥，稱量。

1.3.3 梔子紅色素衍生物的特征吸收波長檢測分別稱取0.1 g 的水溶性梔子紅色素和梔子紅色素衍生物粉末，分別用超純水和無水乙醇溶解，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，分別以超純水、無水乙醇作參比，采用紫外-可見分光光度計（UV-Vis）測定色素溶液400～700 nm 區(qū)間內(nèi)的紫外-可見吸收光譜，確定梔子紅色素衍生物的最大吸收波長（λmax）。

1.3.4 梔子紅色素衍生物的溶解性 分別稱取一定質(zhì)量的水溶性梔子紅色素和梔子紅色素衍生物，加入等體積的各種溶劑中，考察色素的溶解性。

1.3.5 色素色價與色調(diào)的測定

1.3.5.1 色素色價的測定 準(zhǔn)確稱取0.1 g 梔子紅色素衍生物粉末，用無水乙醇溶解，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以無水乙醇作參比，采用紫外-可見分光光度計測定其λmax處的吸光值。參考徐尤智等[11]的測定方法，代入下式計算色價：

1.3.5.2 色素色調(diào)的測定 取適量色素溶于無水乙醇中，稀釋至最大吸收波長下的吸光值A(chǔ)=0.65，用色差儀測定色調(diào)參數(shù)[12]。測定條件：照明光源D65，視角10°。測定參數(shù)：L*，a*，b*。其中，L*值表示溶液的亮度，L*值越大，溶液的亮度越高；a*值表示溶液的顏色紅/綠程度，a*為正值且越大溶液顏色越紅，a*為負(fù)值且越小溶液顏色越綠；b*值表示溶液的顏色黃/藍程度，b*為正值且越大溶液顏色越黃，b*為負(fù)值且越小表示溶液顏色越藍。

1.3.5.3 色素色差的計算 根據(jù)色素的色調(diào)（L*，a*，b*）計算色素在不同條件下放置一段時間后的色差，計算公式[12-13]：

明度差：ΔL*=LS*-LT*

紅/綠差：Δa*=aS*-aT*

黃/藍差：Δb*=bS*-bT*

式中，下標(biāo)S 和T 分別表示樣品色和標(biāo)準(zhǔn)色。

1.3.6 色素殘留率的測定 色素殘留率計算公式：

式中，A后——試驗結(jié)束后的憎水性梔子藍色素衍生物溶液在λmax處的吸光值；A前——試驗前的憎水性梔子藍色素衍生物溶液在λmax處的吸光值。

1.3.7 梔子紅色素衍生物的穩(wěn)定性

1.3.7.1 光照穩(wěn)定性 將梔子紅色素衍生物粉末溶于無水乙醇中，調(diào)吸光值A(chǔ)=0.65，分別在陽光照射（40 000 lux）、燈光直射（13 000 lux）、室內(nèi)散射（300 lux）和陰暗避光（對照）4 種條件下放置6 d，每天取樣測量色素溶液的吸光值及色調(diào)，計算色素殘留率與色差。

1.3.7.2 熱穩(wěn)定性 將梔子紅色素衍生物粉末溶于無水乙醇中，調(diào)吸光值A(chǔ)=0.65，分別在25（室溫），40，60，80，100 ℃5 種條件下避光放置4 h，每1 h 取樣測量色素溶液的吸光值及色調(diào)，計算色素殘留率與色差。

1.3.7.3 pH 穩(wěn)定性 將梔子紅色素衍生物粉末溶于無水乙醇中，調(diào)吸光值A(chǔ)=0.65，以色素原液為對照，分別在pH=3，4，5，7，9，11，13 7 種條件下避光放置24 h，在2，4，8，24 h 取樣測量色素溶液的吸光值及色調(diào)，計算色素殘留率與色差。

1.3.7.4 金屬離子穩(wěn)定性 將梔子紅色素衍生物粉末溶于無水乙醇中，調(diào)吸光值A(chǔ)=0.7，配制0.01 mol/L 的Ka+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Cu2+溶液，將色素溶液與金屬離子溶液9∶1（V∶V）混合，對照為色素溶液與乙醇9∶1（V∶V）的混合溶液，避光放置24 h，分別在2，4，8，24 h 取樣測量色素溶液的吸光值及色調(diào)，計算色素殘留率與色差。

1.3.7.5 氧化-還原穩(wěn)定性 將梔子紅色素衍生物粉末溶于無水乙醇中，調(diào)吸光值A(chǔ)=0.7，配制5%，10%，20%的H2O2-水溶液和2.5，5，10 mg/mL的Na2SO3-水溶液，將色素溶液與H2O2-水溶液或Na2SO3-水溶液9 ∶1（V ∶V）混合，對照為色素溶液與水9∶1（V∶V）混合，避光放置24 h，在2，4，8，24 h 取樣測量色素溶液的吸光值及色調(diào)，計算色素殘留率與色差。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析 每個試驗重復(fù)3 次，采用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)，置信度為95%（P=0.05）

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子紅色素衍生物制備工藝條件優(yōu)化

2.1.1 不同料液比對梔子紅色素衍生物產(chǎn)量的影響 由圖1可知梔子紅色素衍生物的產(chǎn)量在料液比（水溶性梔子紅色素∶乙酸酐）為1∶20（m∶V）時達到最高0.451 g。之后，隨著料液比的增加梔子紅色素衍生物的產(chǎn)量不再增加，說明此時水溶性梔子紅色素與乙酸酐已基本反應(yīng)完全，反應(yīng)的最佳料液比是水溶性梔子紅色素∶乙酸酐=1∶20 （m∶V）。

2.1.2 不同反應(yīng)時間對梔子紅色素衍生物產(chǎn)量的影響 由圖2可知梔子紅色素衍生物的產(chǎn)量在反應(yīng)時間為4 h 時達到最高值0.453 g，之后隨著反應(yīng)時間的增加梔子紅色素衍生物的產(chǎn)量不再增加，說明此時水溶性梔子紅色素與乙酸酐已基本反應(yīng)完全，反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間是4 h。

2.1.3 不同反應(yīng)溫度對梔子紅色素衍生物產(chǎn)量的影響 由圖3可知梔子紅色素衍生物的產(chǎn)量在反應(yīng)溫度為20～60 ℃時達到最高值0.456 g，之后隨著反應(yīng)溫度的增加梔子紅色素衍生物的產(chǎn)量降低，這可能是因為溫度過高造成色素分解，水溶性梔子紅色素與乙酸酐在常溫下反應(yīng)即可。

2.1.4 驗證試驗 由上述單因素試驗獲得最佳反應(yīng)條件：料液比為水溶性梔子紅色素∶乙酸酐=1∶20（m∶V），反應(yīng)時間4 h，反應(yīng)溫度為室溫。在此條件下做驗證試驗，獲得梔子紅色素衍生物0.455 g，色價為63.7，色調(diào)L*=71.01，a*=26.19，b*=-10.12。

2.2 梔子紅色素衍生物的紫外-可見吸收光譜圖

由圖4可知梔子紅色素衍生物的最大吸收波長為531 nm，水溶性梔子紅色素的最大吸收波長為527 nm，肉眼所見紅色及紅紫色的紫外-可見吸收波長為490～550 nm，均為梔子紅色素，而化學(xué)改性使梔子紅色素衍生物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最大吸收波長發(fā)生紅移（向長波長方向移動）。以上述梔子紅色素衍生物的最大吸收波長作為特征吸收峰進行后續(xù)研究。

圖1 不同料液比對色素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different feed liquid ratio on the yield of pigment

圖2 不同反應(yīng)時間對色素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different reaction time on the yield of pigment

圖3 不同反應(yīng)溫度對色素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different reaction temperature on the yield of pigment

圖4 兩種梔子紅色素的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4 UV-Vis absorption spectrogram of two gardenia red pigments

2.3 醇溶性梔子紅色素衍生物的溶解性

水溶性梔子紅色素、醇溶性梔子紅色素衍生物在不同溶劑中的溶解性見表1?；瘜W(xué)改性后，醇溶性梔子紅色素衍生物可溶于無水乙醇和水，其極性有所降低，擴大了溶解范圍。

表1 兩種梔子紅色素在不同溶劑中的溶解性Table 1 Solubility of two gardenia red pigments in different solvents

2.4 醇溶性梔子紅色素衍生物的穩(wěn)定性

2.4.1 光照穩(wěn)定性 醇溶性梔子紅色素衍生物在陽光照射（40 000 lux）、燈光直射（13 000 lux）、室內(nèi)散射（300 lux）和陰暗避光（對照）條件下的光照穩(wěn)定性如圖5和表2所示。圖5表明，醇溶性梔子紅色素衍生物在燈光直射和陽光照射條件下色素?fù)p失較多，6 d 后色素的殘留率僅為29.88%和19.12%；而在室內(nèi)散射和陰暗避光條件下，醇溶性梔子紅色素衍生物較穩(wěn)定，6 d 后色素殘留率為89.86%和86.41%。表2結(jié)果與圖5結(jié)果基本一致，4 種光照條件下亮度差（ΔL*）、紅值差（Δa*）、藍值差（Δb*）和總色差（ΔEab*）的變化程度由大到小為陽光照射、燈光直射、室內(nèi)散射、陰暗避光。

2.4.2 熱穩(wěn)定性 醇溶性梔子紅色素衍生物在室溫（25 ℃，對照），40，60，80，100 ℃條件下的穩(wěn)定性，如圖6和表3所示。圖6結(jié)果表明，溫度越高醇溶性梔子紅色素衍生物的殘留率越低，然而在100 ℃下保溫4 h 后色素的殘留率仍有84.96%。由此表明醇溶性梔子紅色素衍生物的溫度穩(wěn)定性較好。表3與圖6結(jié)果基本一致，5 種溫度條件下亮度差（ΔL*）、紅值差（Δa*）、藍值差（Δb*）和總色差（ΔEab*）的變化程度由大到小為100 ℃＞80 ℃＞60 ℃＞40 ℃＞25 ℃。

圖5 梔子紅色素衍生物的光照穩(wěn)定性-色素殘留率Fig.5 The light stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

圖6 梔子紅色素衍生物的溫度穩(wěn)定性-色素殘留率Fig.6 The thermal stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

表2 梔子紅色素衍生物的光照穩(wěn)定性-色差Table 2 The light stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

表3 梔子紅色素衍生物的溫度穩(wěn)定性-色差Table 3 The thermal stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

2.4.3 pH 穩(wěn)定性 醇溶性梔子紅色素衍生物在pH=3，4，5，7，9，11，13 條件下和色素原液pH=4.5（對照）的穩(wěn)定性如圖7和表4所示。圖7結(jié)果表明，當(dāng)色素溶液在pH=3～4.5 時醇溶性梔子紅色素衍生物的穩(wěn)定性較好，24 h 后色素殘留率在97.49%以上，而在pH≥5 時醇溶性梔子紅色素衍生物的溶液在6 h 時均出現(xiàn)不同程度的沉淀現(xiàn)象，說明醇溶性梔子紅色素衍生物在酸性條件下較穩(wěn)定，中性及堿性條件下易發(fā)生沉淀。表4結(jié)果與圖7結(jié)果基本一致，在pH≥5 時醇溶性梔子紅色素衍生物溶液發(fā)生沉淀，亮度差（ΔL*）、紅值差（Δa*）、藍值差（Δb*）和總色差（ΔEab*）與pH=3～4.5條件下相比變化巨大。

2.4.4 金屬離子穩(wěn)定性 醇溶性梔子紅色素衍生物在多種金屬離子存在的條件下穩(wěn)定性如圖8和表5所示。圖8表明，醇溶性梔子紅色素衍生物溶液中有Sn2+時穩(wěn)定性最差，易發(fā)生沉淀，可能是由于Sn2+與醇溶性梔子紅色素衍生物發(fā)生螯合作用而產(chǎn)生沉淀；在有Fe2+時穩(wěn)定性較差，24 h 后色素殘留率為72.82%；而其它金屬離子對醇溶性梔子紅色素衍生物溶液影響不大。表5結(jié)果與圖8結(jié)果基本一致，Sn2+和Fe2+存在時醇溶性梔子紅色素衍生物溶液24 h 后亮度差（ΔL*）、紅值差（Δa*）、藍值差（Δb*）和總色差（ΔEab*）較大，其它金屬離子存在時色差小。

圖7 梔子紅色素衍生物的pH 穩(wěn)定性-色素殘留率Fig.7 The pH stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

圖8 梔子紅色素衍生物的金屬離子穩(wěn)定性-色素殘留率Fig.8 The metals ion stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

表4 梔子紅色素衍生物的pH 穩(wěn)定性-色差Table 4 The pH stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

表5 梔子紅色素衍生物的金屬離子穩(wěn)定性-色差Table 5 The metals ion stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

（續(xù)表5）

2.4.5 氧化還原穩(wěn)定性 醇溶性梔子紅色素衍生物在不同濃度氧化劑 （H2O2） 和還原劑（Na2SO3） 存在條件下的穩(wěn)定性如圖9和表6所示。圖9表明，醇溶性梔子紅色素衍生物溶液中有氧化劑（H2O2）存在時較穩(wěn)定，24 h 后色素殘留率在86.66%以上；而有還原劑（Na2SO3）時易發(fā)生沉淀，24 h 后色素殘留率最高僅6.37%。表6結(jié)果與圖9結(jié)果基本一致，在有氧化劑（H2O2）時，亮度差（ΔL*）、紅值差（Δa*）、藍值差（Δb*）和總色差（ΔEab*）較小，在有還原劑（Na2SO3）時色差較大。

圖9 梔子紅色素衍生物的氧化還原穩(wěn)定性-色素殘留率Fig.9 The redox stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

表6 梔子紅色素衍生物的氧化還原穩(wěn)定性-色差Table 6 The redox stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

天然色素因色調(diào)自然、安全性高、有營養(yǎng)價值、有藥理作用等優(yōu)點而受到人們青睞，然而其存在溶解范圍窄、穩(wěn)定差、價格較貴等缺點，阻礙了天然色素在食品工業(yè)中的應(yīng)用[14]。此外，在天然色素的發(fā)展中常伴有物理、化學(xué)或生物因素造成的變色、褪色等問題。為了改善天然色素的溶解性及穩(wěn)定性，擴大色素的應(yīng)用范圍，通過添加護色劑、包埋、化學(xué)改性等方法對天然色素進行改良[15]。其中，在化學(xué)改性法方面，有研究學(xué)者采用甲基化法、金屬離子絡(luò)合法、酯化法等方法與色素已有官能團反應(yīng)來改變色素性質(zhì)，從而改變色素的溶解性并提高穩(wěn)定性。如李曉輝[16]利用硫酸二甲酯對蘿卜紅色素進行化學(xué)改性，改性后色素的水溶解率為92%，相比于蘿卜紅色素提升了196%；李炎等[17]采用有機酸鹽與辣椒紅色素反應(yīng)得到可溶于水的辣椒紅色素鋅絡(luò)鹽；Cruz 等[18]采用原花青素與硬脂酰氯發(fā)生酯化反應(yīng)，純化得到得率為70%的親脂性?；ㄇ嗨?；林燕[19]采用順丁烯二酸酐和異丙醇對水溶性紅曲色素進行化學(xué)改性獲得脂溶性紅曲色素；楊志等[20]采用乙酸酐與水溶性梔子藍色素發(fā)生酯化反應(yīng)，得到可溶于無水乙醇的憎水性梔子藍色素；張芳等[21]研究了憎水性梔子藍色素的穩(wěn)定性，結(jié)果表明：色素的吸光值在酸溶液中略有下降而在堿溶液中反而上升；憎水性梔子藍色素對還原劑穩(wěn)定，而在氧化劑存在時褪色明顯；Mg2+和Ca2+有一定護色作用，而Cu2+、Fe2+和Sn2+會使色素出現(xiàn)沉淀。本研究結(jié)果表明，利用酯化法獲得的醇溶性梔子紅色素衍生物可擴大其溶解范圍。

3.2 結(jié)論

采用乙酸酐酯化法制備醇溶性梔子紅色素衍生物，確定其特征吸收波長并考查其溶解性和穩(wěn)定性。其制備最佳工藝條件為：料液比為水溶性梔子紅色素∶乙酸酐=1 ∶20（m ∶V），反應(yīng)時間4 h，反應(yīng)溫度為室溫；醇溶性梔子紅色素衍生物可溶于無水乙醇和水，擴大了溶解范圍；在室內(nèi)散射光、高溫、酸性、氧化劑存在，無Sn2+和Fe2+離子存在的條件下穩(wěn)定性較好。