王海東 蘇曉春 代博娜 倪瑤 李紅杰 錢秀萍,*

(1 常州方圓制藥有限公司，常州 213125；2 上海交通大學(xué)分析測試中心，上海 200240；3 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

抗菌藥物一直被作為臨床感染性疾病治療的重要手段，但由于抗菌藥物合理使用問題的日益突出，耐藥菌株引起的感染是感染性疾病高病死率的主要原因[1]。新型氨基糖苷類抗生素如巴龍霉素(paromomycin)、西索米星(sisomicin)、依替米星(etimicin)、奈替米星(netilmicin)、阿米卡星(amikacin)、阿貝卡星(arbekacin)、妥布霉素(tobramycin)等對耐藥菌感染具有積極的治療作用[2-4]。在阿米卡星合成和工藝改進(jìn)中有兩個(gè)重要的中間體化合物1和化合物2需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證和定量分析，然而化合物1和化合物2無紫外吸收，且無商品化的標(biāo)準(zhǔn)品。氨基糖苷類抗生素的含量檢測有HPLC、熒光法、離子色譜法、流動注射化學(xué)發(fā)光法等[5]。常用的高效液相色譜法(HPLC)需要對樣品進(jìn)行衍生化處理或采用聯(lián)用技術(shù)等復(fù)雜操作，商品化標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏更給定量分析帶來了困難[6]。氫核磁振定量分析(quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)集物質(zhì)鑒別和含量測定于一體已應(yīng)用于新藥研發(fā)、對照品研究和質(zhì)量控制等藥學(xué)領(lǐng)域[7-9]，使用單一參照化合物即可定量多個(gè)組分，而且比值定量測定不需要強(qiáng)度校正，精確度和精密度好，因此對藥物研發(fā)過程中的混合物及含雜質(zhì)樣品的定量分析具有獨(dú)特的優(yōu)勢[9]。本論文采用13C NMR、1H NMR、1H1H-COSY、HMBC和MS對化合物1和化合物2進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，并應(yīng)用1H NMR內(nèi)標(biāo)法測定了其量，為阿貝米卡星的工藝改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Bruker AvanceⅢ 600MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士，Bruker Biospin公司)；島津-LC-20AT HPLC色譜儀(日本，島津)；Mettler Toledo XP6電子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；賽默飛ThermoScientific LTQ orbitrap XL高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀。

重水(D2O，規(guī)格0.5mL，99.9% atom% D)購自Cambridge Isocope Laboratories；馬來酸(TraceSure?)購自WAKO和光純藥工業(yè)株式會社；甲酸鈉(純度99.998%)、冰乙酸(HPLC級)、無水硫酸鈉(HPLC級)購自Aladdin；硫代乙醇酸(HPLC級)、鄰苯二甲醛(HPLC級)、戊烷磺酸鈉(HPLC級)購自TCI；乙醇(HPLC級)購自TEDIA；甲醇(HPLC級)購自Merck；氫氧化鈉(藥檢專用)購自沃凱；硼酸(GR級)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑；水為高純水?；衔?和化合物2由常州方圓制藥有限公司合成。

1.2 1H NMR定量測定

供試溶液配制：準(zhǔn)確稱量化合物1和化合物2約4～22mg、內(nèi)標(biāo)物馬來酸和甲酸鈉約6.5mg于2mL EP管中，加入D2O 0.6mL，超聲(35kHz)10min使其完全溶解，再轉(zhuǎn)移適量至5mm的核磁管中備用。

儀器參數(shù)設(shè)置：采用zg30脈沖序列在恒溫(25℃)下獲取1H NMR譜。具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)：譜寬(SWH)12019.23Hz，采樣點(diǎn)數(shù)(TD)64K，采樣時(shí)間(AQ)2.73s，馳豫延遲時(shí)間(D1)20s，采樣次數(shù)(NS)16次，空掃次數(shù)(DS)2次，探頭溫度298K。在上述NMR采集條件下采集信號，進(jìn)行相位調(diào)整和基線校正后，測定化合物1和化合物2以及對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物定量峰面積的相對比值，采用公式(1)計(jì)算化合物含量。

式中：P為待測樣品純度(%)；As為樣品定量峰的積分面積；ns為樣品定量峰代表氫原子數(shù)；Ms為樣品相對分子質(zhì)量；ms為樣品質(zhì)量(g)；Ar為內(nèi)標(biāo)峰的積分面積；nr為內(nèi)標(biāo)峰所代表氫原子數(shù)；Mr代表內(nèi)標(biāo)的相對分子質(zhì)量；mr內(nèi)標(biāo)質(zhì)量(g)；Wr為內(nèi)標(biāo)物的百分含量。

1.3 鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析

色譜柱：ZORBAXElipse XD B-C18( 250mm×4.6mm,5μm)；流動相A：0.025mol/L戊烷磺酸鈉溶液加0.1mol/L無水硫酸鈉水溶液(乙酸調(diào)pH3.5)，流動相B：甲醇；洗脫程序?yàn)榱鲃酉郃：流動相B：95:5(V/V)；流速：0.9mL/min；檢測波長：330nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：10μL；衍生化試劑：稱取15.6g氫氧化鈉和24.72g硼酸水溶解后加入4%鄰苯二甲醛乙醇溶液，水稀釋至2L，再加入2.0mL硫代乙醇酸混勻；衍生化試劑流速：0.6mL/min；衍生化溫度：55℃。

1.4 LC-LC/MS分析

色譜柱： Agilent ZORBAXSB -C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相A：0.3mol/L三氟乙酸水溶液，流動相B：乙腈；洗脫程序?yàn)榱鲃酉郃:流動相B：96:4(V/V)；進(jìn)樣體積20μL；柱溫40℃；流速：0.9mL/min；N2流速：2.0L/min；正離子掃描30min；掃描范圍：50～2000(m/z)。

2 結(jié)果

2.1 化合物1和化合物2的鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析

對化合物1和化合物2采用鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析，結(jié)果見圖1?；衔?除了保留時(shí)間Rt14.47min的主峰P1外，還含有至少5個(gè)雜質(zhì)，雜質(zhì)峰a、b、c、d、e的HPLC保留時(shí)間分別為Rt9.05、12.05、12.79、16.39和17.55min?；衔?除了Rt 12.17min的主峰P2外，也至少含有a'、b'、c'、d'、e' 5個(gè)雜質(zhì)峰，Rt分別是7.71、8.91、10.67、13.2和15.32min。化合物1的色譜純度(n=3)為95.97%±0.16%，化合物2的色譜純度(n=3)為97.58%±0.02%，結(jié)果見表1。

2.2 NMR分析的溶劑選擇以及化合物1和化合物2的核磁譜圖歸屬和質(zhì)譜分析

本實(shí)驗(yàn)針對NMR常用溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物1、化合物2以及內(nèi)標(biāo)物在D2O有較好的溶解性，而且溶劑峰與樣品、內(nèi)標(biāo)物的吸收峰沒有發(fā)生重疊，因此選擇D2O做溶劑。

圖1 化合物1和2鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of compounds 1 and 2 with postcolumn derivatization of o-phthaldialdehyde

表1 化合物1和2的HPLC純度測定Tab.1 Determination of compounds 1 and 2 by HPLC

對化合物2進(jìn)行解析，由碳譜化學(xué)位移得季碳為C1'δ175.60，由HMBC譜可知?dú)渥V中與C1'相關(guān)氫譜峰為δ3.87～3.84、δ4.11、δ1.95、δ1.80-1.74峰，結(jié)合其他圖譜可確定C1、C2'、C3'，并通過C3'的COSY效應(yīng)確定C4'。H譜中位于低場的δ5.70、δ5.69為雙鍵C3'、C4'，δ5.25、δ4.95為異頭碳C1'、C1''，通過物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析可知只有H3'會與C1'產(chǎn)生HMBC遠(yuǎn)程相關(guān)信號，依此可同時(shí)確定4個(gè)C的歸屬。由H1'、H1''可在HMBC譜中確定C4、C6，并結(jié)合COSY確定C2、C3、C5，由H3'、H4'、H1'可通過COSY確定H2'、H5'、H6'。III環(huán)各C可通過已確定的C1''和6''(因其余4個(gè)仲碳都已確定)通過COSY譜進(jìn)行歸屬。表2為化合物2的13C NMR、1H NMR、1H1H-COSY和HMBC的核磁譜解析數(shù)據(jù)。

同理，由碳譜化學(xué)位移得季碳為δ179.09的C1'，由HMBC譜可得氫譜中與C1'相關(guān)的H峰，結(jié)合其他圖譜可歸屬C1、C2'、C3'，通過HSQC得到相連H的化學(xué)位移，并通過H3'的COSY效應(yīng)確定H4'。除側(cè)鏈兩個(gè)仲碳外，δ63.08為與羥基相連的仲碳C6''，δ47.69為與氨基相連的仲碳C6'，在剩余3個(gè)仲碳中，從找到HNBC譜找到與異頭碳上的Hδ5.179或Hδ5.185遠(yuǎn)程相關(guān)信號，可確定C3'和H1'(同時(shí)得到H1'')。結(jié)合其他二維譜確定C4'和C2。由H1'與H1''可在HMBC譜中確定C4、C6，并結(jié)合H4和H6的COSY信號確定同環(huán)的H2、H3、H5。由H3'、H4'和H1'結(jié)合各二維譜信息確定同環(huán)的H2'、H5'、H6'。III環(huán)各C、H可通過已確定的H1''和H6''，通過COSY譜顯示的同環(huán)自旋體系信息進(jìn)行歸屬。

化合物1和化合物2的結(jié)構(gòu)極為類似，化合物2的核磁譜解析見表2。

經(jīng)MS鑒定化合物1和化合物2的分子離子峰[M+H]+分別為m/z553.5和551.4。碎片離子峰基本一致，[Ⅰ+Ⅲ+H]+為m/z425.1、m/z425.2，[Ⅰ+H]+為m/z264.0、m/z264.1，[Ⅲ+H]+為m/z162.9、m/z163.0。

經(jīng)核磁和質(zhì)譜分析，化合物1為3-氨基-3-脫氧-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-[2,3,4,6-四脫氧-2,6-二氨基-α-D-赤式-己吡喃糖基-(1→4)]-1-N-[(2S)-4-氨基-2-羥基-1-氧丁基]-2-脫氧-D-鏈霉胺，化合物2為3-氨基-3-脫氧-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-[2,3,4,6-四脫氧-2,6 -二氨基-α-D-赤式-3-烯-己吡喃糖基-(1→4)]-1-N-[(2S)-4-氨基-2-羥基-1-氧丁基]-2-脫氧-D-鏈霉胺。化合物1和化合物2屬于2-脫氧-D-鏈霉胺雙取代衍生物，其結(jié)構(gòu)差異僅是己吡喃糖基上單鍵和烯鍵。圖2為化合物1和化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

表2 化合物2的核磁譜解析Tab.2 NMR analysis of compound 2

2.3 內(nèi)標(biāo)物、定量峰的選擇和含量測定

對分別加入內(nèi)標(biāo)物馬來酸、甲酸鈉的化合物1和化合物2進(jìn)行1H NMR譜圖分析(圖3)，馬來酸易于識別的尖銳單峰δ6.23ppm歸屬為烯鍵氫，和化合物1的樣品峰分離完全，互不干擾，因此馬來酸可以作為化合物1的內(nèi)標(biāo)物。化合物1在δ5.05ppm、δ5.66ppm的位移是與氧代相連的碳C1'和C1''上的氫，是與其他信號分離的獨(dú)立尖銳單峰，因此選擇化合物1的δ5.05ppm、δ5.66ppm處的兩個(gè)單峰信號為定量峰。同理，甲酸鈉易于識別的尖銳單峰歸屬為δ8.36ppm，和化合物2的樣品峰不發(fā)生重疊，因此甲酸鈉可以作為化合物2的內(nèi)標(biāo)物?；衔?的δ2.00ppm位移是與C3'相連的-CH2，δ5.72ppm位移為烯鍵氫，這兩組尖銳單峰與其他信號峰分離完全，因此選擇該兩組峰為化合物2的定量峰(由積分方法可知，核磁內(nèi)標(biāo)計(jì)算含量的計(jì)算方法不夠詳細(xì)，有無減少認(rèn)為誤差的措施)化合物1、2進(jìn)行1H NMR內(nèi)標(biāo)法測定，樣品重復(fù)測試6次，化合物1和化合物2的含量分別為64.98%±2.38%和75.38%±2.82%。

圖2 化合物1和化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structure of compound 1 and compound 2

圖3 化合物1、2和內(nèi)標(biāo)物的1H NMR相應(yīng)峰Fig.3 1HNMR peak of compounds 1,2 and internal standards

3 討論

化合物1和化合物2屬于2-脫氧-D-鏈霉胺雙取代衍生物，是第三代氨基糖苷類抗生素合成過程中的重要中間體。這兩個(gè)化合物是結(jié)構(gòu)非常接近的類似物，但分子結(jié)構(gòu)中己吡喃糖基上單鍵和烯鍵的差異，使化合物的極性發(fā)生改變，因此無紫外吸收的化合物1和化合物2在鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析中有較好的區(qū)分度，但無法購買商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品是HPLC法定量測定的障礙?；衔?和化合物2的HPLC色譜純度均大于95%，但由于樣品易吸水、成鹽性和雜質(zhì)等干擾，色譜純度并不能真正反映化合物1和2的濃度，需要提供足夠量的樣品以測定樣品的水分及熾灼殘?jiān)?。qNMR具有樣品制備簡單、無需標(biāo)準(zhǔn)品、準(zhǔn)確、專一性高和不破壞樣品等優(yōu)點(diǎn)，是定量測定研發(fā)過程中樣品量少且無商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品化合物的有效方法。在qNMR分析中，弛豫延遲時(shí)間、激發(fā)脈角度、采樣次數(shù)是影響定量的主要參數(shù)[9-10]。激發(fā)脈沖角度越小需要的弛豫延遲時(shí)間越短。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過比較，在保證基線平直和高信噪比的條件下，激發(fā)脈沖角度30°、弛豫延遲時(shí)間20s、掃描次數(shù)選擇16次時(shí)，樣品和內(nèi)標(biāo)物馬來酸、甲酸鈉的定量峰積分可以滿足準(zhǔn)確度的要求。D2O對樣品和內(nèi)標(biāo)物有較好的溶解性，且不產(chǎn)生干擾，因此選擇D2O作為qNMR的溶劑。化合物1和化合物2的定量峰選擇峰形較好，周圍沒有干擾的峰。內(nèi)標(biāo)物馬來酸δ6.23ppm的烯鍵氫峰、甲酸鈉δ8.36ppm的氫峰與所測樣品的定量峰分離良好，且不產(chǎn)生干擾，因此選擇馬來酸和甲酸鈉作為內(nèi)標(biāo)物。

越來越多的研究報(bào)道了qNMR測定的化合物濃度與質(zhì)量平衡法濃度高度一致。qNMR法可以克服HPLC法缺少標(biāo)準(zhǔn)品帶來的困擾，定性分析和定量分析可同步完成，方法簡單、準(zhǔn)確，為氨基糖苷類新藥合成的過程檢測和質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)手段。