任炳楠，王連珂，田丹丹，王文華，田惠子，韓 涵，岳利敏，杜冰會(huì)，張衛(wèi)東

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南省人民醫(yī)院高血壓科 鄭州 450003 3)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)作為一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物。健康成人空腹血漿Hcy水平是5～15 μmol/L，高于15 μmol/L可被診斷為高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)[1-3]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些Hcy代謝相關(guān)的酶基因突變，或者一些特殊環(huán)境因素(如B族維生素缺乏等)均可導(dǎo)致Hcy代謝的紊亂，引起Hcy水平的異常升高，HHcy作為多種心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了人類(lèi)健康[4-5]。目前，口服葉酸作為最常見(jiàn)的治療手段，長(zhǎng)期服用可以顯著降低20%～30%的總體Hcy水平[6-9]，但葉酸對(duì)于HHcy的治療效果仍然存在很大爭(zhēng)議，有許多病例療效仍不理想。大部分研究?jī)H僅報(bào)道了葉酸長(zhǎng)期補(bǔ)充后血漿Hcy水平的下降情況，而Hcy是否降至正常水平卻很少有人關(guān)注。

甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Betaine-homocysteine methyltransferase, BHMT)參與了Hcy的再甲基代謝過(guò)程，其不依賴(lài)于維生素B12，并只活躍于肝腎細(xì)胞中[10]。人類(lèi)的BHMT基因位于5號(hào)染色體，rs3733890是常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，該多態(tài)性已經(jīng)被證實(shí)同神經(jīng)管畸形、唐氏綜合征、唇腭裂、宮頸癌、乳腺癌、頭頸部癌等多種疾病有關(guān)[11-16]。在該研究中，作者將探討B(tài)HMT rs3733890多態(tài)性與葉酸治療HHcy效果的關(guān)聯(lián)性，并分析基因-環(huán)境交互作用對(duì)療效的影響。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象作者建立了一個(gè)前瞻性隊(duì)列研究，篩選于2014年7月至12月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的漢族患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①血漿Hcy水平>15 μmol/L，被診斷為HHcy。②年齡在18歲以上。③自愿參與本研究并接受90 d的葉酸補(bǔ)充治療?；颊哂幸韵氯我粭l件則被排除：①使用過(guò)口服避孕藥。②患有嚴(yán)重感染、肝腎疾病、血液疾病、消化系統(tǒng)疾病、甲狀腺功能異常或惡性腫瘤。③過(guò)去2周內(nèi)服用過(guò)B族維生素、抗癲癇藥、降壓藥、他汀類(lèi)藥物或其他影響Hcy代謝的藥物(如甲氨蝶呤、阿司匹林等)。本研究由鄭州大學(xué)生命科學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或其親屬簽署知情同意書(shū)。

1.2基線調(diào)查與隨訪所有納入研究的患者均接受為期90 d的口服葉酸(5 mg/d)干預(yù)治療。通過(guò)調(diào)查問(wèn)卷，在研究開(kāi)始前收集患者的社會(huì)人口學(xué)資料(如年齡、性別、婚姻狀況等)和臨床信息。在干預(yù)治療前采集所有患者空腹靜脈血檢測(cè)Hcy。分別于治療中期(第45天)和治療結(jié)束時(shí)(第90天)進(jìn)行2次電話隨訪，對(duì)服藥依從性進(jìn)行評(píng)估。此外，于治療結(jié)束時(shí)進(jìn)行第2次血漿Hcy水平的檢測(cè)。

1.3療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)與分組依據(jù)根據(jù)第2次血漿Hcy水平評(píng)估療效。如Hcy水平≤15 μmol/L，認(rèn)為葉酸干預(yù)治療有效，患者被納入治療成功組。反之，則認(rèn)為干預(yù)失敗，患者被納入治療失敗組。

1.4實(shí)驗(yàn)室檢查與基因分型實(shí)驗(yàn)均在本課題組分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。使用熒光偏振免疫分析法檢測(cè)空腹血漿Hcy水平。使用苯酚/氯仿提取全基因組DNA。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05。②連鎖不平衡r2>0.8。③功能性SNP。使用Sequenom公司的時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)(MassArray系統(tǒng))對(duì)BHMT rs3733890位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)連續(xù)變量的正態(tài)性和方差齊性，選擇t檢驗(yàn)或U檢驗(yàn)比較兩組間變量的差異；分類(lèi)變量使用百分比表示，使用χ2檢驗(yàn)比較兩組間變量的差異。使用logistic回歸分析BHMT rs3733890基因多態(tài)性與葉酸治療效果的關(guān)聯(lián)性。使用分層分析探究基因-環(huán)境的交互作用。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組患者基線特征的比較共有1 071例HHcy患者納入本研究。在治療過(guò)程中175例服藥依從性較差或者中途失訪被排除，253例2次隨訪的服藥依從性均為一般，也從研究中排除。此外，有5例的基因型未被檢出，未納入分析。最終共有638例進(jìn)入分析。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知2組人群年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療失敗組吸煙、糖尿病、高血壓、冠心病患者的比例、基線血漿Hcy水平均高于治療成功組。

表1 2組基線特征比較

2.2BHMT rs3733890多態(tài)性與葉酸療效的關(guān)聯(lián)性該位點(diǎn)的基因型與等位基因在2組人群中的分布見(jiàn)表2。治療成功組人群的基因型分布符合哈德溫伯格平衡(χ2=0.06，P=0.972)。Logistic回歸結(jié)果顯示，相較于GG基因型攜帶者，AA型攜帶者葉酸治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)更高。排除年齡、性別、吸煙、飲酒和婚姻狀況的混雜影響以后，關(guān)聯(lián)性依舊存在。

表2 BHMT rs3733890多態(tài)性與葉酸療效的關(guān)聯(lián)

*：調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、婚姻狀況

2.3BHMT基因-環(huán)境交互作用對(duì)葉酸療效的影響見(jiàn)表3。由表3可知，與攜帶野生型(GG)的不吸煙、不飲酒者相比較，攜帶突變基因型(GA+AA)的吸煙、飲酒患者葉酸治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。此外，突變基因型與糖尿病、高血壓和冠心病史也存在著明顯的協(xié)同作用，葉酸治療失敗風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。

表3 BHMT基因-環(huán)境交互作用對(duì)葉酸療效的影響

3 討論

HHcy作為一個(gè)危險(xiǎn)因素，影響多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。大量的流行病學(xué)研究[4-8]已經(jīng)證實(shí)，補(bǔ)充葉酸可以有效地降低血漿Hcy水平。然而，許多治療無(wú)效的病例卻沒(méi)有得到廣泛的關(guān)注。作者前期的研究[17]結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)了90 d的葉酸(5 mg/d)補(bǔ)充以后，仍有超過(guò)40%的HHcy患者血漿Hcy水平?jīng)]有降至正常(5～15 μmol/L)。但關(guān)于治療失敗的原因，仍沒(méi)有一致的結(jié)論。

Hcy可以通過(guò)再甲基化過(guò)程形成蛋氨酸，這一過(guò)程包含兩條途徑。在最重要的第一條通路中，由5-甲基四氫葉酸作為甲基供體，在蛋氨酸合成酶的催化作用下，以維生素B12作為輔酶，將Hcy轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，可降低血漿中Hcy的水平。而另一條通路則只存在于肝腎細(xì)胞中，以甜菜堿作為甲基供體，在BHMT的催化作用下，不依賴(lài)于B族維生素的輔酶作用，將Hcy轉(zhuǎn)化為蛋氨酸，并生成二甲基甘氨酸(dimethylglycine，DMG)[18]。作者先前在第一條代謝通路上的研究[19]已經(jīng)證明，亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)的rs1801133和rs1801131位點(diǎn)，以及蛋氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase， MTRR)的rs1801394和rs162036位點(diǎn)的基因多態(tài)性同葉酸治療HHcy的療效存在關(guān)聯(lián)，并且rs1801133位點(diǎn)與冠心病和高血壓之間存在交互作用，直接影響到葉酸的治療效果。而目前缺乏關(guān)于第二條代謝通路的研究，僅有少數(shù)研究[20]表明，BHMT基因功能的改變可能會(huì)引起Hcy水平的升高，并進(jìn)一步導(dǎo)致血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的上升。作者推測(cè)：BHMT rs3733890基因多態(tài)性可能影響葉酸治療HHcy的效果，而基因-環(huán)境交互作用對(duì)于精準(zhǔn)降Hcy可能有著更有效的預(yù)測(cè)作用。因此，作者通過(guò)在河南漢族HHcy人群中的前瞻性隊(duì)列研究來(lái)系統(tǒng)性地分析這些問(wèn)題。

該研究結(jié)果顯示，BHMT rs3733890突變等位基因A和基因型可以升高葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險(xiǎn)；這一結(jié)果在排除相關(guān)混雜因素之后依舊成立。Li等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，BHMT rs3733890位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)義突變以后，盡管不引起酶活性的改變，但突變基因蛋白產(chǎn)物的米氏常數(shù)更低，與甜菜堿和Hcy之間的親和力更強(qiáng)，使再甲基反應(yīng)更容易發(fā)生。然而，此反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的DMG。Liu等[22]研究結(jié)果顯示，DMG與Hcy水平之間存在正相關(guān)，DMG水平可以作為總Hcy水平變化的預(yù)測(cè)因子。因此，這也解釋了為什么攜帶突變基因的HHcy患者經(jīng)過(guò)葉酸治療以后失敗比例更高。

Da等[11]在巴西人群中所做的研究發(fā)現(xiàn)，BHMT rs3733890 GA/AA基因型可與吸煙協(xié)同作用，升高頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Hobbs等[23]的研究結(jié)果顯示，相較于體重正常且攜帶有GG基因型的女性而言，攜帶GA/AA基因型的肥胖女性生育先天性心臟病孩子的概率升高了1.8倍。盡管關(guān)于BHMT基因-環(huán)境交互作用影響葉酸療效的潛在機(jī)制尚未得到充分的研究，但有研究[11, 24]顯示，乙醇和尼古丁等有害物質(zhì)的攝入會(huì)改變?nèi)~酸攝入與總DNA甲基化水平之間的關(guān)聯(lián)，提示吸煙和飲酒會(huì)通過(guò)影響體內(nèi)一碳單位代謝，進(jìn)一步影響到DNA的合成和甲基化水平。本研究結(jié)果也顯示BHMT rs3733890多態(tài)性與一些環(huán)境因素間存在交互作用，突變基因型對(duì)葉酸治療效果的影響被環(huán)境因素增強(qiáng)，導(dǎo)致了更高的失敗風(fēng)險(xiǎn)。因此，作者推測(cè)，BHMT基因與環(huán)境的交互作用可能會(huì)通過(guò)改變Hcy代謝和DNA甲基化水平，影響葉酸治療的結(jié)局。

總之，在河南漢族HHcy患者中，BHMT rs3733890基因多態(tài)性與口服葉酸治療HHcy的效果存在密切關(guān)聯(lián)，基因-環(huán)境的交互作用會(huì)直接影響到葉酸的療效。然而，由于研究的樣本量有限，并且在隨訪過(guò)程中存在著失訪和依從性較差等問(wèn)題，因此，在下一階段，課題組將開(kāi)展大型的多中心大樣本的研究，提升依從性，進(jìn)一步驗(yàn)證該研究結(jié)果。