郭騰飛，軒青霞，吳玉丹，董仕楨，高 磊，陳 攀，常永超，高 強

1)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 河南洛陽 471003 2)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 河南洛陽 471003 3)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院消化內(nèi)科 北京 100144

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)，近年來在我國其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。IBD的病因和發(fā)病機制尚未明確，目前認(rèn)為IBD是一種多因素相互作用的腸道障礙性疾病，包括遺傳因素、宿主免疫反應(yīng)、腸道菌群、環(huán)境因素等[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是膜型及分泌型蛋白質(zhì)合成及折疊的主要場所，此外也可參與脂質(zhì)合成、能量代謝以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+的貯存和釋放等，是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)發(fā)生堆積，便會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，從而產(chǎn)生一系列的細(xì)胞自我保護(hù)性反應(yīng)，統(tǒng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。ERS可通過3條信號通路激活UPR，分別為活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶[protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase，PERK]、肌醇需求酶1 (inositol requiring enzyme 1，IRE1)[2-4]。ERS與多種人類疾病相關(guān)，在IBD的發(fā)展過程中起著重要的作用[5]。ATF6屬于Ⅱ型膜轉(zhuǎn)運蛋白，正常情況下與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein of 78 kDa, GRP78)結(jié)合處于未激活狀態(tài)。當(dāng)發(fā)生ERS時，GRP78與ATF6解離，從而激活A(yù)TF6通路[6]。ATF6可以影響C/EBP同源蛋白(CHOP)，CHOP參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化以及細(xì)胞型特異性基因能量代謝相關(guān)過程的調(diào)控[7]。本研究應(yīng)用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)小鼠急性腸炎模型，通過對GRP78、IRE1α、PERK、ATF6、CHOP等表達(dá)情況的檢測，探討GRP78-ATF6-CHOP通路與小鼠結(jié)腸炎之間的關(guān)系，以期為IBD發(fā)病機制的研究及治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物6～8周齡、體重為19～25 g的健康清潔級雄性129S1/SvJ種系小鼠(購自深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部)飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院開元院區(qū)動物實驗中心，室內(nèi)燈光明暗交替周期設(shè)置為12 h，維持濕度在50%左右，室內(nèi)溫度在20～22 ℃，給予小鼠足量SPF級混合配方飼料(北京華阜康生物公司)，小鼠自由飲水，并每日定時更換新鮮飲水，保持小鼠生活環(huán)境清潔衛(wèi)生及通風(fēng)良好。每日觀察小鼠的攝食飲水量、大便性狀及活動情況，確認(rèn)小鼠健康且適應(yīng)環(huán)境。

1.2主要試劑DSS購自美國MP Biomedicals 公司，相對分子質(zhì)量為36 000～50 000；GRP78(ab21685)、ATF6(ab37149)和CHOP(ab11419)抗體均購自美國Abcam 公司；GAPDH(sc-32233)抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗鼠(BA1054)、羊抗兔(BA1050)二抗、SABC即用型小鼠(SA1021)/兔(SA1022) IgG免疫組化試劑盒、ECL試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；大便隱血試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成(表1)；DAB顯色試劑盒、中性樹脂購自北京索萊寶科技有限公司。

表1 引物序列和退火溫度

1.3結(jié)腸炎動物模型的建立及標(biāo)本留取采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為對照組和DSS組，每組8只。對照組飲用無菌蒸餾水，DSS組飲用30 g/L DSS溶液，自由飲用6 d。每組小鼠均給予充足SPF級混合飼料。第6天腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，處死，剪開腹腔取出全部結(jié)腸，觀察結(jié)腸性狀，并測量結(jié)腸長度；翻轉(zhuǎn)結(jié)腸，用預(yù)冷PBS清洗結(jié)腸內(nèi)部糞便，自遠(yuǎn)端剪取結(jié)腸組織約5 mm放入體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后4 μm厚切片，常溫保存以備HE及免疫組化染色使用；另外自遠(yuǎn)端剪取約10 mm結(jié)腸組織，立即放入RNAlater中，4 ℃放置24 h后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，備mRNA檢測使用；再剪取約10 mm結(jié)腸組織，液氮冷凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，備Western blot檢測使用。

1.4觀測指標(biāo)及組織病理學(xué)評分動物模型建立期間每日上午及下午觀察小鼠，觀察指標(biāo)：反應(yīng)機警性、活動情況、毛發(fā)光澤度、大便性狀和大便帶血情況，稱量小鼠的進(jìn)食量以及飲水量，運用隱血檢測試劑盒檢測大便隱血情況，下午4點準(zhǔn)時稱量體重。按照J(rèn)ackson等[8]方法進(jìn)行DAI評分，DAI評分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)小鼠大便性狀(正常、松散、稀便)、大便帶血情況(正常、隱血陽性、肉眼血便)及體重下降百分比3項指標(biāo)分別進(jìn)行評分，然后取三者平均值即為DAI評分結(jié)果。小鼠結(jié)腸組織切片行HE染色，在400倍光鏡下觀察，按照 Esworthy等[9]評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)評分，炎癥的臨界值定義為6分。

1.5小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、GRP78、IRE1α、PERK、ATF6和CHOP mRNA的qRT-PCR檢測使用Trizol法提取小鼠結(jié)腸組織總RNA，運用核酸定量儀測定RNA濃度與純度。取2 μg總RNA行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。冰上配?5 μL PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，DNase/RNase-free水8.5 μL，SYBR Premix EX Taq Ⅱ (2×) 12.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計40個循環(huán)。每個樣本做3個復(fù)孔，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析各項指標(biāo)mRNA相對表達(dá)量。

1.6小鼠結(jié)腸組織中GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)的檢測

1.6.1 免疫組化法 結(jié)腸組織切片經(jīng)常規(guī)乙醇梯度脫蠟后行染色，一抗GRP78(兔多克隆抗體)、ATF6(兔多克隆抗體)、CHOP(鼠單克隆抗體)分別按1∶1 000、1∶300、1∶200稀釋，以PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃冰箱過夜后，滴加相應(yīng)二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下觀察，每張切片選擇10個視野(×200)，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。參考文獻(xiàn)[10]的方法對GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)情況進(jìn)行評分。

1.6.2 Western blot 取約50 mg小鼠結(jié)腸組織于EP管中，加入1 mL RIPA裂解液勻漿后置于冰上30 min，4 ℃離心后取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。與蛋白上樣緩沖液充分混勻后，100 ℃變性10 min，取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉液封閉1 h。GRP78、ATF6、CHOP一抗均按1∶1 000稀釋，4 ℃過夜，二抗(1∶2 000)室溫2 h。ECL顯色3 min，經(jīng)成像系統(tǒng)成像，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較兩組小鼠第6天體重變化、DAI評分、結(jié)腸長度、組織病理學(xué)評分、炎癥因子、GRP78、ATF6、CHOP mRNA及蛋白表達(dá)的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1小鼠一般狀況、DAI評分、結(jié)腸組織病理學(xué)評分的比較對照組小鼠活動自如，體毛光澤，攝食飲水正常，生長發(fā)育良好，體重增加。DSS組于造模第3天開始出現(xiàn)體毛凌亂，活動量減少，攝食量及飲水量減少，小鼠肛周潮濕明顯并出現(xiàn)稀便、大便隱血陽性等現(xiàn)象；第6天全部小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重肉眼血便，體重下降約15%。與對照組相比，第6天DSS組DAI評分(3.8±0.3)增高，結(jié)腸長度縮短(P<0.05)。HE染色可見對照組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤(圖1A1)；DSS組可見黏膜上皮細(xì)胞廣泛缺失，腺體多數(shù)不完整，杯狀細(xì)胞缺失，黏膜及黏膜下層細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞廣泛浸潤，呈嚴(yán)重炎癥改變(圖1B1)；與對照組相比，DSS組組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠第6天體重變化、DAI、結(jié)腸長度、組織病理學(xué)評分比較

A：對照組；B：DSS組；1：HE染色；2：GRP78蛋白；3：ATF6蛋白；4：CHOP蛋白

2.2小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、GRP78、IRE1α、PERK、ATF6和CHOP mRNA表達(dá)的比較見表3。由表3可知，與對照組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α、GRP78、ATF6和CHOP mRNA表達(dá)水平在DSS組顯著增高(P<0.05)。

表3 兩組小鼠結(jié)腸組織炎癥因子和ERS相關(guān)分子mRNA的表達(dá)

*:DSS組與對照組相比

2.3兩組小鼠結(jié)腸組織中GRP78、ATF6和CHOP蛋白的表達(dá)見圖1。GRP78蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜。ATF6蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞胞質(zhì)及胞核，也可表達(dá)于刷狀緣；CHOP蛋白主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的胞核中。DSS組3種蛋白的表達(dá)較對照組明顯上調(diào)(表4)。

表4 兩組小鼠結(jié)腸組織中GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)情況

3 討論

IBD在西方國家屬于常見病，特別是北美、北歐、西歐、澳大利亞等地區(qū)和國家[11]。近年來隨著人們生活水平、生活環(huán)境、醫(yī)療環(huán)境等因素的改變，IBD在中國等亞洲低發(fā)病率國家的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[11]。IBD主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液血便等癥狀，病程遷延不愈，發(fā)作與緩解交替，并可伴發(fā)多種腸道外癥狀及并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12-13]。本研究所建立的小鼠急性腸炎模型表現(xiàn)出腹瀉、黏液血便、體重下降等與人類結(jié)腸炎相似的臨床癥狀，病理組織學(xué)觀察可見小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞廣泛缺失，局部糜爛，腺體多數(shù)不完整，黏膜及黏膜下細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，杯狀細(xì)胞消失，中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，呈嚴(yán)重炎癥改變；炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA在炎癥組表達(dá)顯著升高。

GRP78在正常情況下可與IRE1、PERK、ATF6的管腔域結(jié)合，使后者處于非激活狀態(tài)；當(dāng)發(fā)生ERS時，GRP78便與通路蛋白解離，使其處于激活狀態(tài)，因此，GRP78被認(rèn)為是ERS發(fā)生的標(biāo)志[14]。本研究中DSS組小鼠結(jié)腸組織中GRP78 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，與陳夢露等[10]的研究一致，說明本研究DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中ERS起到重要作用。

ATF6在維持組織穩(wěn)態(tài)及正常發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[15]。當(dāng)發(fā)生ERS時，ATF6與GRP78解離，并轉(zhuǎn)運至高爾基復(fù)合體，經(jīng)蛋白水解酶1(site-1 protease, S1P)和S2P裂解，形成活化型ATF6，并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)GRP78、GRP94、XBP1、CHOP等的表達(dá)，幫助蛋白質(zhì)折疊、分泌和降解[15-16]。研究[17]顯示，ATF6通路在UC患者結(jié)腸上皮中被激活，表達(dá)上調(diào)。此外，Hanaoka等[18]研究顯示，ATF6在潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)直腸癌癌前不典型病變中表達(dá)上調(diào)。CHOP也稱GADD153或者DDIT3，正常情況下CHOP表達(dá)量很低，參與多種疾病的病理性凋亡過程，包括神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病、缺血性疾病和腫瘤等[14,19]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生ERS時，CHOP可通過多種途徑被激活從而誘導(dǎo)凋亡，如PERK-eIF2α-ATF4-CHOP、ATF6-CHOP等[14]。Xu等[20]的研究顯示ATF6-CHOP通路的激活在腦內(nèi)出血的大鼠模型中可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用。然而，在IBD病理過程中，激活CHOP引起凋亡的機制目前尚未明確。本研究顯示DSS組與對照組IRE1α和PERK mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而DSS組ATF6和CHOP mRNA及蛋白均上調(diào)，說明CHOP在IBD腸道上皮細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮了作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，GRP78-ATF6-CHOP通路的激活參與了IBD的發(fā)生發(fā)展，該研究結(jié)果可能為IBD的治療探索提供新的理論依據(jù)。