張 孟，呂啟梅，蘇曉嵐，灑榮波

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271000）

紅曲酒是中國(guó)傳統(tǒng)名酒，屬于漢代制曲釀酒的一個(gè)重大發(fā)明[1]。紅曲酒作為黃酒中的一種傳統(tǒng)保健酒，具有活血化瘀、健脾暖胃之療效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)它還具有降血脂[2]、降血糖[3]、抗氧化[4]、降血壓[5]等功效。在紅曲酒生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上，加入一種或多種中藥材混合發(fā)酵，可以釀制保健紅曲酒，在很大程度上迎合了人們對(duì)低度保健酒的需求。黃精是我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，性平、味甘，具有補(bǔ)血益氣、滋腎潤(rùn)肺、生津補(bǔ)脾等功效[6]。泰山醫(yī)學(xué)院釀造協(xié)會(huì)經(jīng)過(guò)兩年潛心研究，研發(fā)出了一種工藝成熟的具有保健功能的黃精紅曲酒，相對(duì)于市場(chǎng)上的同類產(chǎn)品，具有獨(dú)特的工藝特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。

黃精紅曲酒中含有多種生理活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)元素，如紅曲色素[7]、Monacolin K[8-10]、氨基酸[11-12]、γ-氨基丁酸[13]等。黃精紅曲酒中的氨基酸一部分來(lái)自原料黃精，一部分來(lái)自微生物的代謝作用，是評(píng)價(jià)紅曲黃酒風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)[14]。目前，氨基酸的測(cè)定方法有顯色法、氨基酸自動(dòng)分析儀、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法等[15]。其中，高效液相色譜法測(cè)定氨基酸以其靈敏度高、重復(fù)性好應(yīng)用最為廣泛，其原理是使用衍生試劑對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生后在檢測(cè)器下的響應(yīng)值進(jìn)行定性和定量。以異硫氰酸苯酯（PITC）作為柱前衍生劑的氨基酸分析方法以其反應(yīng)速度快，產(chǎn)物單一、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用，其與紫外檢測(cè)器結(jié)合，可提供較高的靈敏度，檢出限約為1 pmol/L[16]。黃精紅曲酒中的游離氨基酸種類和含量檢測(cè)迄今為止未見(jiàn)報(bào)道。本文以PITC衍生法檢測(cè)了自釀的黃精紅曲酒中的游離氨基酸種類和含量，為產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

黃精紅曲酒：泰山醫(yī)學(xué)院釀造協(xié)會(huì)研發(fā)。

糯米購(gòu)于吉林市永鵬農(nóng)副產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司；白曲購(gòu)于廣西全州縣全發(fā)酒曲廠；紅曲米購(gòu)于麗水力克生物科技有限公司；黃精粉，購(gòu)于陜西柏科生物工程有限公司。

17種氨基酸混合標(biāo)樣：天門冬氨酸（Asp）；谷氨酸（Glu）；絲氨酸（Ser）；甘氨酸（Gly）；組氨酸（His）；精氨酸（Arg）；蘇氨酸（Thr）；丙氨酸（Ala）；脯氨酸（Pro）；酪氨酸（Tyr）；纈氨酸（Val）；蛋氨酸（Met）；異亮氨酸（Ile）；亮氨酸（Leu）；苯丙氨酸（Phe）；賴氨酸（Lys），購(gòu)自美國(guó)沃特世公司，氨基酸的濃度均為2.5 mmol/L；乙腈（色譜純）購(gòu)自德國(guó)默克公司；異硫氰酸苯酯，乙酸鈉、正己烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

安捷倫1200高效液相色譜儀；安捷倫1200二極管陣列檢測(cè)器；Milli-Q超純水制備機(jī)。

1.2 自釀黃精紅曲酒生產(chǎn)操作要點(diǎn)

（1）浸米：選用優(yōu)質(zhì)糯米，浸米時(shí)間為24 h，浸米完畢瀝干。

（2）蒸飯：將浸好的糯米放入蒸鍋中，至有蒸汽產(chǎn)生后繼續(xù)加熱15 min。

（3）淋飯：糯米蒸透后，立即用冷水沖淋，使其降溫至30℃左右。

（4）落缸搭窩：將蒸好涼透的糯米置于發(fā)酵罐中，加入0.5%的白曲混合均勻。將中間的糯米挖空，搭窩。

（5）糖化：糖化48 h，窩內(nèi)聚集至五分之四的液體后，糖化結(jié)束。

（6）發(fā)酵：向糖化好的糯米醅中加入10%的紅曲米，另加入與原料米量1∶1的純凈水，攪拌混合均勻，進(jìn)入紅曲發(fā)酵階段。每隔2 d攪拌糯米醅，將上面的糯米粒壓到下面，直到發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵階段持續(xù)10 d。

（7）從發(fā)酵的第5天開(kāi)始，向糯米醅中加入0.5%的黃精粉，混合均勻。

（8）壓榨過(guò)濾：發(fā)酵結(jié)束后，用200目的束口布袋過(guò)濾酒醅，過(guò)濾液投入到澄清罐中自然沉降。2 d后用虹吸管將澄清罐中的上清液移入玻璃瓶中。

（9）巴氏滅菌：將裝滿紅曲酒的玻璃瓶放入巴氏滅菌器中滅菌后，放于陰涼處保存。

1.3 試劑配制

0.1mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液：準(zhǔn)確移取120μL異硫氰酸苯酯溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

1 mol/L三乙胺-乙腈溶液：準(zhǔn)確移取1.398 mL三乙胺至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

乙酸鈉緩沖鹽溶液：準(zhǔn)確稱量2.72 g三水乙酸鈉于1000 mL水中，充分溶解后，用0.45μm水相濾膜過(guò)濾后備用。

1.4 樣品衍生化

向2 mL離心管中加入氨基酸混合標(biāo)樣或經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾的黃精紅曲酒樣品50μL和150μL超純水，再加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液100μL和1 mol/L三乙胺-乙腈溶液100μL后振蕩混勻。靜置1 h后加入正己烷400μL，充分振蕩后靜置10 min，待溶液分層后取下層溶液進(jìn)行HPLC分析。

1.5 色譜條件

色譜柱使用美國(guó)SMA氨基酸分析柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相A為乙酸鈉緩沖液-乙腈（97∶3，V/V），流動(dòng)相B為乙腈-水（4∶1，V/V），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)樣的定性

本文試驗(yàn)了Agilent TC-C18柱、Ultimate XB C-18、ODS通用柱和美國(guó)SMA氨基酸專用分析柱對(duì)氨基酸標(biāo)樣中的17種氨基酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)使用美國(guó)SMA氨基酸專用分析柱檢測(cè)可以使氨基酸標(biāo)樣中的17種氨基酸達(dá)到基線分離，在選定的分離條件下，其分離效果和穩(wěn)定性最好。17種氨基酸分離色譜圖如圖1—圖3所示。

圖1 17種氨基酸混合標(biāo)樣高效液相色譜圖

圖2 自釀黃精紅曲酒中氨基酸檢測(cè)色譜圖

圖3 市售黃精紅曲酒中氨基酸檢測(cè)色譜圖

2.2 檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限（表2）

表2 17種氨基酸的線性回歸方程、檢測(cè)限和分離度

將氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5 mmol/L）按2倍梯度逐漸稀釋至0.01 mmol/L，按照上述的色譜條件進(jìn)行紫外檢測(cè)，以各氨基酸色譜峰峰面積y對(duì)氨基酸濃度x進(jìn)行回歸分析，得到線性回歸方程。結(jié)果表明，除天冬氨酸和谷氨酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍較窄外（分別為0.08～2.5 mmol/L和0.16～2.5 mmol/L），其他氨基酸基本在0.02～2.5 mmol/L范圍內(nèi)均具有較好的線性關(guān)系，所有氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線在設(shè)定的線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均≥0.99。

2.3 樣品中氨基酸種類和含量的測(cè)定

自釀黃精紅曲酒和市售黃精紅曲酒中氨基酸的HPLC檢測(cè)色譜圖如圖2和圖3所示。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，自釀黃精紅曲酒中氨基酸的種類比市售黃精紅曲酒氨基酸的種類要少，自釀黃精紅曲酒和市售黃精紅曲酒中均沒(méi)有天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸，自釀黃精紅曲酒中檢測(cè)到了13種氨基酸，市售黃精紅曲酒中檢測(cè)到了14種氨基酸。從氨基酸含量來(lái)看，除丙氨酸外，自釀黃精紅曲酒中所能檢測(cè)到的氨基酸含量均比市售黃精紅曲酒中的要高，如自釀黃精紅曲酒比市售黃精紅曲酒中賴氨酸含量要高出5倍。自釀黃精紅曲酒中的總氨基酸含量為3947.1 mg/L，市售黃精紅曲酒中的總氨基酸含量為2701.1 mg/L，前者比后者在氨基酸總量上多出近50%。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)自釀黃精紅曲酒進(jìn)行等量的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。樣品平均加標(biāo)回收率在73.6%～102.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.45%～6.34%范圍之間，可以滿足自釀黃精紅曲酒中氨基酸含量測(cè)定的要求。

表3 自釀黃精紅曲酒和市售黃精紅曲酒中的氨基酸種類和含量檢測(cè)結(jié)果

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將17種氨基酸混合標(biāo)樣在本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)條件下連續(xù)進(jìn)樣3次，考察檢測(cè)方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，17種氨基酸的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.2%～0.7%范圍以內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

本研究成功建立了一種快速有效的檢測(cè)自釀黃精紅曲酒中的游離氨基酸含量的方法，經(jīng)PITC衍生后，17種氨基酸在36 min以內(nèi)均得到了基線分離，檢測(cè)時(shí)間優(yōu)于已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)中氨基酸的檢測(cè)時(shí)間。利用建立的方法對(duì)自釀黃精紅曲酒和一種市售黃精紅曲酒中的游離氨基酸種類和含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自釀黃精紅曲酒中的氨基酸種類要少于市售黃精紅曲酒；但自釀黃精紅曲酒中氨基酸總量比市售黃精紅曲酒高出近50%。從氨基酸的呈味特征來(lái)分析，苦味氨基酸和甜味氨基酸占據(jù)了兩種酒樣中氨基酸總量的絕大部分，澀味氨基酸僅占近10%的比例。

在所檢測(cè)的氨基酸中，按照呈味特征可以分為4類：甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、脯氨酸和蛋氨酸為甜味氨基酸；纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸為苦味氨基酸；天冬氨酸和谷氨酸為鮮味氨基酸；酪氨酸為澀味氨基酸。從呈味特征方面對(duì)酒樣中氨基酸風(fēng)味進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，苦味氨基酸和甜味氨基酸是兩種紅曲酒樣品中的主要氨基酸組分，分別占到了氨基酸總量的93%和92%，澀味氨基酸含量最少，分別僅占7%和8%，鮮味氨基酸在兩種酒樣中均沒(méi)有檢測(cè)到。

圖4 兩種酒樣中氨基酸的風(fēng)味分析

氨基酸作為黃精紅曲酒中非常重要的一類風(fēng)味物質(zhì)，其快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，一直受到人們的高度關(guān)注。本研究方法的成功建立，為紅曲酒生產(chǎn)企業(yè)研究其風(fēng)味物質(zhì)來(lái)源研究提供了理論依據(jù)，將在很大程度上促進(jìn)我國(guó)保健紅曲酒的發(fā)展。