李悅悅，章 斌，原永芳

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011)

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的未抽花莖植株的干燥根。味辛甘，性溫，能解表祛風(fēng)、勝濕、止痙。用于感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢和破傷風(fēng)。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，其具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過(guò)敏、抗驚厥等作用[1-4]。其主要成分包括揮發(fā)油、色原酮類、有機(jī)酸、香豆素類、聚炔類、多糖類等化合物[5-8]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，本課題組前期研究[9]運(yùn)用HPLC-TOF-MS技術(shù)研究了防風(fēng)入血原型成分，但未尋找血液中防風(fēng)代謝產(chǎn)物，且僅對(duì)化合物進(jìn)行了初步推斷。本實(shí)驗(yàn)首次采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)鑒定大鼠血漿中防風(fēng)的入血成分及代謝產(chǎn)物，共鑒定了大鼠血漿中21個(gè)來(lái)源于防風(fēng)的化合物，包括10個(gè)入血原型成分和11個(gè)代謝產(chǎn)物，并推測(cè)其入血成分的代謝途徑，為進(jìn)一步研究防風(fēng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)、Agilent6530 Accurate-Mass Q-TOF-MS串聯(lián)四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國(guó)安捷倫公司)；Masshunter Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件，高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Therma公司)。

1.2 材料

防風(fēng)藥材產(chǎn)自內(nèi)蒙古，購(gòu)自上海德康大藥房，并由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室孫連娜副教授鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的干燥根。分析用水均使用超純水，甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其余試劑為分析純。所有的溶劑和樣品在進(jìn)入高效液相色譜之前均經(jīng)過(guò)0.22 μm纖維濾膜濾過(guò)。

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。采用代謝籠法(每籠1只)飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房，室溫22℃，濕度72%，12 h晝夜交替，自由采食、飲水。實(shí)驗(yàn)前禁食 12 h。

2 方法

2.1 防風(fēng)水煎液的制備

稱取防風(fēng)飲片500g，粉粹后于5 L水(10倍水量)中浸泡1 h，煮沸后煎煮1 h，趁熱濾過(guò)，藥渣再加水煎煮1 h后濾過(guò)，合并2次濾液，濃縮至1.4g/ml,為灌胃給藥用防風(fēng)水煎液。將其稀釋200倍，0.22μm 微孔濾膜濾過(guò)，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

2.2 動(dòng)物給藥與血漿樣品采集

4只雄性Wistar大鼠，給藥前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前先經(jīng)眼眶靜脈取血0.2 ml(空白對(duì)照)，然后以21g/kg劑量防風(fēng)水煎液給大鼠灌胃，參照防風(fēng)色原酮類成分的藥動(dòng)學(xué)特征[10]分別于給藥后10、30、60、120、240 min，從大鼠眼眶取血0.2 ml，2800×g離心10 min后，分離血漿，置-80℃冰箱保存。

2.3 血漿樣品處理

加300μl乙腈至100μl血樣中，渦旋3 min，于10400×g高速離心5 min，取上清，等量混合不同時(shí)間點(diǎn)血樣上清，氮?dú)獯蹈?35℃)，然后復(fù)溶于100 μl甲醇，10400×g高速離心3 min，取上清3 μl進(jìn)樣分析。

2.4 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm，Agilent)；柱溫25 ℃，流速0.3 ml/min，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～5 min，5%～30% B；5～10 min，30%～40% B；10～16 min，40%～95% B；16～18 min，95% B；進(jìn)樣量3 μl。

質(zhì)譜條件：采用正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)參數(shù)：毛細(xì)管電壓正、負(fù)離子模式下分別為4 000 V和3 500 V、干燥氣流速11 L/min、干燥氣溫度350 ℃、噴霧氣壓45 psig、碎裂電壓120 V、Skimmer電壓60 V、數(shù)據(jù)采集范圍m/z100～1100，選取m/z121.0509和m/z922.0098的內(nèi)標(biāo)離子作實(shí)時(shí)質(zhì)量數(shù)校正。進(jìn)一步對(duì)防風(fēng)入血成分和代謝產(chǎn)物離子進(jìn)行MS/MS分析，碰撞能量根據(jù)分子量調(diào)節(jié)。

3 結(jié)果與分析

運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，通過(guò)比較防風(fēng)水煎液、空白血漿和大鼠灌胃防風(fēng)水煎液后的血漿圖譜，獲得入血原型成分及代謝物。對(duì)于有對(duì)照品的化合物，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間、特征碎片離子來(lái)確定其結(jié)構(gòu)及分子式，對(duì)于無(wú)對(duì)照品的化合物，根據(jù)文獻(xiàn)及碎片離子信息來(lái)確定其結(jié)構(gòu)及分子式。最終在大鼠血漿樣品中分析鑒定出10個(gè)入血原型成分和11個(gè)代謝產(chǎn)物，具體見(jiàn)表1所示；正離子模式下總離子流圖(TIC)見(jiàn)圖1所示。

3.1 入血原型成分的鑒定

圖1的離子峰1、5、7、13、14、17、18、19、20和 21與相應(yīng)對(duì)照品及防風(fēng)水煎液譜圖的保留時(shí)間比較，并比對(duì)相應(yīng)碎片離子信息，分別鑒定為防風(fēng)的原型成分腺苷、divaricatacid、升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、去甲升麻素、(3S)-2,2-二甲基-3,5-二羥基-8-羥甲基-3,4-二氫-2H,6H-苯并[1,2-b:5,4-b’]雙吡喃-6-酮、5-O-甲基維斯阿米醇、亥茅酚苷和紫花前胡苷元；峰7的保留時(shí)間(tR=4.998 min)與升麻苷對(duì)照品的保留時(shí)間(tR=5.024 min)相近，其準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z為469.1726，其碎片離子基峰為脫去一分子糖[M+H-C6H10O5]+的m/z為307，與升麻素[M+H]+的m/z一致，因此峰7鑒定為升麻苷。峰 13 的保留時(shí)間(tR=5.943 min)與升麻素對(duì)照品的保留時(shí)間(tR=5.952 min)相近，其[M+H]+的m/z為307.1171，碎片離子289、259、235、221、205和177與升麻素對(duì)照品碎片離子一致，參考文獻(xiàn)報(bào)道[8]，推測(cè)其裂解規(guī)律如圖3所示，峰 13鑒定為升麻素。峰14的保留時(shí)間(tR=6.025 min)與5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品的保留時(shí)間(tR=6.029 min)相近，其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的m/z為453.1740，其主要碎片離子為脫去一分子糖[M+H-C6H10O5]+后m/z為291，與5-O-甲基維斯阿米醇[M+H]+的m/z一致，其他碎片離子273，243，219，205，189與5-O-甲基維斯阿米醇一致，因此峰14鑒A.ESI+模式定為5-O-甲基維斯阿米醇苷。峰17、18為同分異構(gòu)體，tR分別為7.290和7.725 min，[M+H]+的m/z為293.1025，均具有碎片離子275[M+H-H2O]+、221[M+H-C4H8O]+，與防風(fēng)水煎液圖譜對(duì)比，結(jié)合化合物Clog P值，推斷峰17和18分別為去甲升麻素和(3S)-2,2-二甲基-3,5-二羥基-8-羥甲基-3,4-二氫-2H,6H-苯并[1,2-b:5,4-b’]雙吡喃-6-酮(Clog P值分別為0.9053和1.1753)。峰19的保留時(shí)間(tR=7.817 min)與5-O-甲基維斯阿米醇對(duì)照品的保留時(shí)間(tR=7.822 min)相近，其[M+H]+的m/z為291.1231，其碎片離子273[M+H-H2O]+、243[M+H-H2O-2CH3]+、219[M+H-C4H8O]+、205[M+H-H2O-2CH3-C3H2]+、189[M+H-H2O-2CH3-C3H2O]+和161[M+H-H2O-2CH3-C3H2O -CO]+與升麻素有相似的裂解規(guī)律，說(shuō)明與其具有相同的呋喃色原酮母核結(jié)構(gòu)，因此，鑒定其為5-O-甲基維斯阿米醇。峰5(tR=4.831 min)的[M+H]+的m/z為321.0974，其碎片離子303[M+H-H2O]+、273[M+H-H2O- 2CH3]+、249[M+H-C4H8O]+、235[M+H-H2O-2CH3-C3H2]+亦符合呋喃色原酮類化合物的裂解規(guī)律，因此，推斷其為divaricatacid。峰20的保留時(shí)間(tR=7.887 min)與亥茅酚苷對(duì)照品的保留時(shí)間(tR=7.892 min)相近，[M+H]+m/z為439.1606，其碎片離子277、259、205與亥茅酚苷對(duì)照品一致，因此鑒別峰20為亥茅酚苷。峰21(tR=7.961 min)的[M+H]+m/z為247.0963，其碎片離子229[M+H-H2O]+、187[M+H-H2O-C3H6]+，與文獻(xiàn)報(bào)道的紫花前胡苷元碎片離子相同，因而推斷其為防風(fēng)的香豆素類成分紫花前胡苷元。

圖1 防風(fēng)水煎液大鼠體內(nèi)成分提取離子流圖下防風(fēng)水煎液; B.ESI+模式下空白血漿; C.ESI+模式下給藥防風(fēng)水煎液大鼠血漿； D.ESI-模式下空白血漿；E.ESI-模式下給藥防風(fēng)水煎液大鼠血漿

表1 防風(fēng)在大鼠體內(nèi)的入血成分及代謝產(chǎn)物

圖2 正離子模式下升麻素質(zhì)譜碎片信息

圖3 升麻素可能的質(zhì)譜裂解途徑(┐H+ 表示[M+H]+)

圖4 升麻素的代謝途徑

3.2 代謝物的鑒定

防風(fēng)的主要入血成分為色原酮類化合物，其代謝途徑主要包括氧化、還原、水解、葡萄糖醛酸化等。以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇為例，說(shuō)明其主要代謝物的鑒別和體內(nèi)代謝途徑。

3.2.1升麻素的體內(nèi)代謝物

峰2、3、4和9的分子式均為C16H18O7(相對(duì)分子質(zhì)量322.1053，[M+H]+的m/z分別為323.1122、323.1127、323.1120和323.1133)，其tR依次為4.291、4.57、4.652和5.241 min。與升麻素(C16H18O6)相比，增加了16[M+O]+，根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量及誤差，可以推測(cè)峰2、3、4和9均為升麻素的羥基化代謝物。峰2的產(chǎn)物離子305比升麻素的碎片離子289多16質(zhì)量數(shù)[289+O]，而碎片離子m/z259、235和221和升麻素的碎片離子相同，說(shuō)明其羥基在2’-或5’位。峰3與峰2的碎片離子相同，無(wú)法根據(jù)碎片離子區(qū)分峰3與峰2；通過(guò)Chemdraw軟件計(jì)算其Clog P值，峰2與峰3分別為-0.8591和-0.7565，由此推斷峰2與峰3分別為2’-羥基升麻素和5’-羥基升麻素。峰4的產(chǎn)物離子275比升麻素的碎片離子259多16質(zhì)量數(shù)[259+O]，說(shuō)明其羥基在3’-或8位。峰9具有與峰4相同的碎片離子247[M-H2O-2CH3-CO]、232[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，結(jié)合Clog P值(3’-羥基升麻素和8-羥基升麻素分別為-0.3647和-0.0188)，推斷峰4和峰9分別為3’-羥基升麻素和8-羥基升麻素。峰8[M+H]+的m/z為483.1498，與升麻素相比，增加了176[M+C6H8O6]，且其碎片離子307、289、259和235與升麻素的分子離子峰及碎片離子相同，可以推測(cè)峰8為升麻素-O-葡萄糖醛酸苷。升麻素的代謝途徑見(jiàn)圖4所示。

3.2.25-O-甲基維斯阿米醇的體內(nèi)代謝物

峰10、11、15和16的分子式均為C16H18O6(相對(duì)分子質(zhì)量306.1103，[M+H]+的m/z分別為307.1183、307.1183、307.1184和307.1165)，其tR依次為5.547、5.772、6.23和6.745 min。與5-O-甲基維斯阿米醇(C16H18O5)相比，增加了16[M+O]+，根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量及誤差，可以推測(cè)峰10、11、15和16均為5-O-甲基維斯阿米醇的羥基化代謝物。峰16具有碎片離子259[M-H2O-2CH3]和235[M-C4H8O]，比5-O-甲基維斯阿米醇碎片離子243、219分別增加了16[M+O]+，另有231[M-H2O-2CH3-CO]和216[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，因而推斷峰16為8-羥基-5-O-甲基維斯阿米醇。峰15的產(chǎn)物離子包括259[M-H2O-2CH3]、231[M-H2O-2CH3-CO]和216[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，推斷其為3’-羥基-5-O-甲基維斯阿米醇。峰10與峰11的碎片離子相似，包括289[M-H2O]、271[M-2H2O]、231[M-H2O-2CH3-CO]，通過(guò)Chemdraw軟件計(jì)算5-O-甲基維斯阿米醇的2-羥基、5-羥基、3-羥基和8-羥基代謝物的Clog P值分別為0.6779、0.7806、1.1723和1.5081，因而推斷峰10和峰11分別為2-羥-5-O-甲基維斯阿米醇和5-羥基-5-O-甲基維斯阿米醇。峰6在負(fù)離子模式下[M-H]-的m/z為275.0926，與5-O-甲基維斯阿米醇(C16H18O5)相比，減少了14[M-CH2]-，另有碎片離子260、245、217，推斷其為脫甲基-5-O-甲基維斯阿米醇。

4 討論

運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，可以從復(fù)雜的生物樣品中得到無(wú)干擾的代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜信息。本實(shí)驗(yàn)采用該技術(shù)，通過(guò)與對(duì)照品、防風(fēng)水煎液圖譜比對(duì)，分析代謝產(chǎn)物的碎片離子，鑒定了大鼠血漿中防風(fēng)的入血成分和代謝產(chǎn)物；共檢測(cè)到10個(gè)入血原型成分和11個(gè)代謝產(chǎn)物。防風(fēng)入血成分的主要代謝途徑包括羥化、去甲基和葡萄糖醛酸化。本研究為首次利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)防風(fēng)體內(nèi)成分進(jìn)行研究，為防風(fēng)藥效物質(zhì)的尋找奠定了基礎(chǔ)。