劉興國　白雯靜　田妮娜　李巖　劉荔

【摘 要】目的：探討不同種屬紅細胞在溶血實驗中替代動物實驗方面的差異性。方法：選用20批次洗發(fā)劑進行家兔眼刺激實驗，使用同批次樣品進行兩種不同哺乳動物紅細胞溶血實驗，根據(jù)各自不同的分級標(biāo)準(zhǔn)，將紅細胞溶血試驗與動物實驗進行相關(guān)性分析。結(jié)果：按照相應(yīng)的分級標(biāo)準(zhǔn)，綿羊紅細胞溶血實驗對比分析結(jié)果：Kappa=0.426，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.598，豬紅細胞溶血實驗對比分析結(jié)果：Kappa=0.531，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.464。兩種動物紅細胞溶血試驗結(jié)果對比分析結(jié)果，Kappa=0.358，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.413。結(jié)論：實驗結(jié)果說明兩種實驗方法有一定的相關(guān)性，紅細胞溶血實驗?zāi)茉谝欢ǚ秶鷥?nèi)取代兔眼刺激實驗，且紅細胞種屬不影響實驗結(jié)果。

【關(guān)鍵詞】化妝品;眼刺激性實驗;替代方法;紅細胞溶血實驗

中圖分類號： S481.1文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）32-0232-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.32.109

A Comparative Study of Different Hemolysis Experiments Instead of Rabbit Eye Stimulation Experiments

LIU Xing-guo BAI Wen-jing TIAN Ni-na* LI Yan LIU Li

（Lanzhou institute for food and drug control， Lanzhou Gansu 730050，China）

【Abstract】Objective： To explore the differences of red blood cells of different species in the hemolysis experiment instead of the animal experiment. Methods： 20 batches of shampoo were selected for rabbit eye irritation test， and the same batch of samples were used for red blood cell hemolysis test of two different mammals. According to different grading standards， the correlation between red blood cell hemolysis test and animal experiment was analyzed. Results： According to the corresponding grading standards， the comparative analysis results of sheep red blood cell hemolysis test： Kappa=0.426， Spearman correlation coefficient 0.598， and pig red blood cell hemolysis test： Kappa=0.531， Spearman correlation coefficient 0.464. The comparative analysis results of erythrocyte hemolysis test results of the two animals showed that Kappa=0.358 and Spearman correlation coefficient was 0.413. Conclusion： The experimental results show that there is a certain correlation between the two experimental methods. Red blood cell hemolysis test can replace rabbit eye stimulation test in a certain range， and the red blood cell species does not affect the experimental results.

【Key words】Cosmetics; Eye irritation test; Alternative methods; Erythrocyte hemolysis test

兔眼刺激性試驗（Draize 試驗）是指動物眼球接觸到化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的過程，是目前評估眼刺激性的金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，通過實驗人員肉眼觀察血紅蛋白的漏出和變性進行評分，方法周期長、成本高，存在一定的主觀性和差異性;同時，隨著動物保護運動的興起和人們對“3R”運動的關(guān)注[3]，體外替代試驗的研究已廣泛開展[4-7]。

本研究擬通過20批次洗發(fā)類產(chǎn)品驗證考察紅細胞溶血試驗實驗用于此類化妝品眼刺激性評價的可能性及不同種屬血樣的差異性。

1 材料與方法

1.1 樣品

全部樣品均來源于蘭州市藥品檢驗所送檢的化妝品，共20個批次樣品，均為洗發(fā)類。

1.2 綿羊紅細胞懸液、豬紅細胞懸液購自北京博爾西科技有限公司，100mL/瓶，其中紅細胞濃度為2×108個/mL，4℃條件下保存，1個月內(nèi)使用。

1.3 實驗動物

新西蘭大耳白兔，普通級，雌雄兼用，雌性未孕，購自蘭州畜牧獸醫(yī)研究所，并飼養(yǎng)在蘭州市食品藥品檢驗所藥理室普通級動物房。實驗動物合格證：SCXK（甘）2015-0001號。

1.4 主要儀器及試劑

主要儀器：艾本德紫外分光光度計BioSpectrometer basic，低溫高速離心機Centrifuge5424R，電子天平 MS205DU，控溫搖床KS4000。PBS（Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，NaCl8g，KCl0.2g，溶于1000ml純化水中，pH為7.4，121℃滅菌30min），十二烷基硫酸鈉（SDS）（1000mg/L）。

1.5 紅細胞溶血實驗

先進行預(yù)試驗預(yù)測樣品的HD50范圍。樣品用PBS配制成濃度為10000mg/L（w/v）的貯備液，超聲振蕩使其完全溶解。取不同濃度的樣品溶液（逐級稀釋貯備液至1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L）。取不同濃度的受試樣品溶液、PBS、0.01%十二烷基硫酸鈉、蒸餾水各1.5mL于試管內(nèi)，分別各加入0.5mL綿羊紅細胞懸液、豬紅細胞懸液充分混勻。在32℃水浴中振蕩孵育30min，然后以10000r/min的速度離心2min，取上清液，分別讀取540nm、560nm、575nm波長下的吸光度（A）。以560nm的Abs計算溶血率（HR）：HR=A受試管/A全溶管×100%，預(yù)測受試樣品導(dǎo)致半數(shù)紅細胞溶血的濃度范圍，以指導(dǎo)正式實驗時樣品濃度的設(shè)置。根據(jù)預(yù)試結(jié)果調(diào)整各受試樣品濃度。正式實驗時設(shè)置5個樣品濃度，實驗方法同預(yù)實驗。溶血率的計算同預(yù)實驗，并計算血紅蛋白變性指數(shù)（DI）=R樣品/RSDS×100%，R樣品、RSDS分別為樣品和SDS上清液A575/A540值。主要觀察指標(biāo)：50%紅細胞發(fā)生溶血時的樣品濃度（HD50）、蛋白質(zhì)變性指數(shù)（DI）、HD50與變性變性指數(shù)DI的比值（IP=HD50/DI）。

家兔眼刺激實驗按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007）對受試樣品進行眼刺激性分級[8]。

1.6 統(tǒng)計方法

以受試樣品濃度為橫坐標(biāo)，溶血率為縱坐標(biāo)作直線回歸，根據(jù)直線回歸方程計算導(dǎo)致50%紅細胞溶解時的樣品濃度（HD50值），同時計算DI和IP。應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。以兔眼刺激性實驗結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，進行Kappa檢驗和Spearman相關(guān)系數(shù)的計算，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，紅細胞溶血實驗刺激性分級結(jié)果和動物實驗分級結(jié)果進行比較，判斷兩種實驗結(jié)果分級的頻數(shù)差別是否存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細胞溶血實驗結(jié)果

紅細胞溶血實驗的分級為：IP≥100、10≤IP<100、1≤IP<10、0.1≤IP<1和IP<0.1分別表示無刺激性、微刺激性、輕刺激性、刺激性和嚴(yán)重刺激性5個級別[9]。溶血率與樣品濃度存在一定的線性關(guān)系，以樣品濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，溶血率為縱坐標(biāo)可求得HD50值（R2≥0.95）。同時求得HD50時的 DI 和IP。

2.2 兔眼刺激性實驗結(jié)果

分級標(biāo)準(zhǔn)為無刺激性、微刺激性、輕刺激性、刺激性和嚴(yán)重刺激性5個級別。20批洗發(fā)劑中，等級為無刺激性的樣品11種，微刺激性樣品7種，輕刺激性2種。

3 統(tǒng)計分析

（1）綿羊紅細胞溶血實驗結(jié)果和兔眼刺激性實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，Kappa=0.426，認為兩者分級一致性尚可;Spearman相關(guān)系數(shù)為0.598，說明兩者之間存在一定的相關(guān)性。

（2）豬紅細胞溶血實驗結(jié)果和兔眼刺激性實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，Kappa=0.531，認為兩者分級一致性尚可;Spearman相關(guān)系數(shù)為0.464，說明兩者之間存在一定的相關(guān)性。

（3）兩種動物紅細胞溶血試驗后結(jié)果進行統(tǒng)計分析，Kappa=0.358，兩者分級相對一致;Spearman相關(guān)系數(shù)為0.413，兩者之間存在一定的相關(guān)性。

4 討論

紅細胞溶血實驗作為動物實驗的一種替代方法，雖然具有一定的局限性，但仍不失為一種可靠性較高的組合策略之一。其本質(zhì)為化學(xué)物質(zhì)對細胞膜的破壞從而引起一系列的炎性反應(yīng)。不同結(jié)構(gòu)化合物損傷紅機制有較大差異，這就限制了該實驗的應(yīng)用范圍。本實驗選擇溶血和血紅蛋白變性兩個檢測指標(biāo)，采用2種哺乳動物紅細胞進行溶血實驗，并進行兔眼刺激性實驗，探討紅細胞溶血實驗替代傳統(tǒng)眼刺激實驗用于化妝品眼刺激性評價的可靠性，并對血液來源種屬差異是否會對眼刺激替代實驗的結(jié)果造成影響進行了初步評估。結(jié)果顯示，兩種方法的實驗結(jié)果在一定刺激性范圍內(nèi)存在相當(dāng)?shù)囊恢滦?，表明可作為化妝品眼刺激性的評價的初篩手段，兩種種屬紅細胞替代實驗與兔眼刺激性實驗結(jié)果的一致性和相關(guān)性程度接近，故認為紅細胞溶血實驗替代兔眼刺激性實驗不存在種屬差異。

紅細胞溶血實驗簡單快速，具有較好的眼刺激性預(yù)測能力，作為化妝品眼刺激性的篩選策略，是一種比較有潛力的離體替代方法，也很有可能成為替代實驗的組合實驗中的重要組成部分，將來如能加強在比色方面的研究，有希望成為一種可靠地快速檢驗方法。本研究中遇到的問題以及方法的局限性：溶血實驗過程中不同化合物對紅細胞膜的破壞有差別，且本研究中樣品刺激性范圍有限，不能從整體上反映出溶血作用的范圍;在實驗過程中，樣品所含色素影響吸光度的測定，有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，且前處理過程時間較長影響到對紅細胞的溶解性，這些問題都是將來需要進一步研究并解決的。

【參考文獻】

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[2]Eloisa NA，Rosaura de FP，Octuvio AFP，et al.A Reassessment of the In Vitro RBC Haemolysis Assay with Defibrinated Sheep Blood for the Determination of the Ocular Irritation Potential of Cosmetic Products：Comparison with the In Vivo Draize Rabbit Test[J].ATLA，2008，21（12）：275-284.

[3]Balls M， Riddell RJ， Worden AN.Animal and alternatives in Toxicity Testing. London： Academic Press， 1983.Balls M，Riddell RJ， Worden A N， Animal and alternatives in Toxicity Testing.London： Academic Press， 1983.

[4]Hayashi T， Itagaki H， Fukuda T， et al.Multivariate factorial analysis of data obtained in seven in vitro test systems for predicting eye irritancy. Toxicology in vitro.1994;8：215-220.

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[6]張文改，楊杏芬.基于細胞的眼刺激性體外替代方法建立與化妝品限刺激性逐步檢測策略的初步研究（碩士學(xué)位論文）[D].廣州：中山大學(xué)，2007：15-18.