徐亞雄 羅香林 豐俊 李楚凌

【摘要】 目的 探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)電離輻射所致豚鼠聽(tīng)功能和耳蝸毛細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法 24只豚鼠， 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、EGCG+輻射組及輻射組， 每組8只。EGCG+輻射組及輻射組于造模前3 d開(kāi)始腹腔注射EGCG（25 mg/1000 g）及等量的生理鹽水，?2次/d;對(duì)照組不做任何處理。在照射前第4天及照射后第8天檢測(cè)所有豚鼠的聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位（ABR）閾值， 照射8 d后于顯微鏡下計(jì)數(shù)毛細(xì)胞數(shù)量。比較三組的ABR閾值檢測(cè)結(jié)果、耳蝸鋪片及細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 干預(yù)后8 d， EGCG+輻射組ABR閾值（38.1±3.3）dB低于輻射組的（49.4±8.6）dB， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;干預(yù)后8 d， EGCG+輻射組和輻射組的ABR閾值與干預(yù)前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB對(duì)比明顯升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。輻射組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量降低， 形態(tài)改變， 排列雜亂不齊， 造模成功;EGCG+輻射組顯微鏡鏡檢表明耳蝸毛細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比有所降低， 排列較為雜亂， 但與輻射組相比形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1102.23±80.55）個(gè)， EGCG+輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（758.56±143.27）個(gè)， 輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（527.00±165.23）個(gè)， EGCG+輻射組、輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于對(duì)照組， 輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)低于EGCG+輻射組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 對(duì)豚鼠預(yù)防性注射EGCG能夠有效降低電離輻射對(duì)聽(tīng)功能和耳蝸毛細(xì)胞損傷作用， 對(duì)電離輻射所致的聽(tīng)力損傷具有一定的防護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯;電離輻射;豚鼠;聽(tīng)功能;耳蝸毛細(xì)胞

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.29.111

目前， 臨床針對(duì)惡性腫瘤的治療， 已經(jīng)逐漸將電離輻射作為常用治療手段， 但是在治療的過(guò)程中， 該治療手段容易對(duì)患者造成一定負(fù)性影響， 如導(dǎo)致其細(xì)胞、非靶組織出現(xiàn)嚴(yán)重受損的情況。其中對(duì)于頭頸部腫瘤患者來(lái)說(shuō)， 在進(jìn)行放射治療中最為常見(jiàn)的一種并發(fā)癥便是感音性耳聾（SNHL）。且目前已有相關(guān)研究表明輻射對(duì)耳蝸毛細(xì)胞具有損傷作用， 能夠改變毛細(xì)胞的形態(tài)[1]。綠茶提取物——EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在較多的酚羥基， 具有較強(qiáng)的抗氧化能力[2];EGCG能夠通過(guò)抑制炎性因子及纖維化調(diào)節(jié)因子等轉(zhuǎn)錄分泌， 緩解肝臟中CCl4所導(dǎo)致的氧化應(yīng)急反應(yīng)[3]。因此， 抗氧化劑EGCG對(duì)電離輻射所致的耳蝸損傷的作用具有較高的研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取24只雄性健康成年豚鼠作為研究對(duì)象， 體重300～350 g， 耳廓反射檢查正常， 由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供;按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、EGCG+輻射組及輻射組， 每組8只。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 耳蝸損傷模型的建立 EGCG+輻射組及輻射組采用10%水合氯醛麻醉后， 固定于鼠板上， 采用自制的“U”形夾頭鉛板遮蔽豚鼠非處理部分， 60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行一次性的60Co照射70 Gy， 照射深度為2.0 cm， 照射范圍以耳蝸為中心的2 cm×2 cm范圍內(nèi);對(duì)照組豚鼠不做處理。輻射組檢測(cè)ABR閾值高于對(duì)照組則表明耳蝸損傷模型造模成功。

1. 2. 2 給藥方法 EGCG+輻射組及輻射組于造模前3 d開(kāi)始腹腔注射EGCG（25 mg/1000 g）及等量的生理鹽水， 2次/d;對(duì)照組不做任何處理。

1. 2. 3 ABR檢測(cè) 在照射前第4天及照射后第8天檢測(cè)所有豚鼠的ABR， 采用10%水合氯醛麻醉。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顱頂正中皮下作為正極， 給聲側(cè)耳廓后作為負(fù)極。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行以2000 Hz為主的短聲進(jìn)行刺激， 刺激間隔時(shí)間為90 ms， 帶通濾波50～3000 Hz， 共刺激200次， 掃描時(shí)程為20 ms。聲波開(kāi)始強(qiáng)度以95 dB開(kāi)始， 并以5 dB為梯度逐漸降低， 觀察P3波以確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兩耳的ABR閾值。

1. 2. 4 耳蝸鋪片觀察毛細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)及計(jì)數(shù) 照射8 d后刺死動(dòng)物同時(shí)取右側(cè)聽(tīng)泡打開(kāi)， 于蝸尖處開(kāi)孔， 以暴露卵圓窗和圓窗。蝸尖采用0.5%的硝酸銀溶液沖洗2～3次， 隨后采用10%的多聚甲醛灌入后日光下曝光2～3 h， 取基底膜于100倍光鏡下觀察毛細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)及計(jì)數(shù)， 由底回段到頂回段逐級(jí)計(jì)數(shù)， 計(jì)數(shù)各回段每排毛細(xì)胞在單位長(zhǎng)度內(nèi)的個(gè)數(shù)， 各回段計(jì)數(shù)總和即為毛細(xì)胞總數(shù)。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較三組的ABR閾值檢測(cè)結(jié)果、耳蝸鋪片及細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組ABR閾值檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 干預(yù)后8 d， EGCG+輻射組ABR閾值（38.1±3.3）dB低于輻射組的（49.4±8.6）dB， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;干預(yù)后8 d， EGCG+輻射組與輻射組的ABR閾值與干預(yù)前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB對(duì)比明顯升高， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 三組耳蝸鋪片及細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)比 耳蝸鋪片顯微鏡計(jì)數(shù)檢查表明， 輻射組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量降低， 形態(tài)改變， 排列雜亂不齊， 造模成功;EGCG+輻射組顯微鏡鏡檢表明耳蝸毛細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比有所降低， 排列較為雜亂， 但與輻射組相比形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1102.23±80.55）個(gè)， EGCG+輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（758.56±143.27）個(gè)， 輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（527.00±165.23）個(gè)， EGCG+輻射組、輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于對(duì)照組， 輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)低于EGCG+輻射組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

放射治療是現(xiàn)階段鼻咽癌、腮腺癌等頭頸部惡性腫瘤使用較多的常規(guī)治療方式， 主要放射治療區(qū)域包括耳在內(nèi)的顳骨區(qū)。在針對(duì)患者進(jìn)行臨床治療時(shí)， 患者存在不同程度的聽(tīng)力降低情況， 通過(guò)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)常規(guī)治療劑量的放射線， 便會(huì)對(duì)內(nèi)耳耳蝸造成一定程度損傷， 導(dǎo)致患者聽(tīng)力下降[4]， 另外相關(guān)研究進(jìn)一步證明， 內(nèi)耳損傷的程度與放射劑量相關(guān)， 現(xiàn)階段多認(rèn)為放射劑量達(dá)到60 Gy時(shí)即可導(dǎo)致內(nèi)耳出現(xiàn)損傷， 為頭頸部惡性腫瘤最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一， 現(xiàn)階段臨床中多以50 Gy為內(nèi)耳損傷的劑量臨界值[5]。EGCG為茶多酚中抗氧化作用最高的成分之一， 該物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中富含酚羥基， 其抗氧化能力為超氧化物歧化酶的6倍、維生素E的20倍， 具有較強(qiáng)的抗炎、清除機(jī)體自由基以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)等多種作用[6]。

本研究采用EGCG對(duì)電離輻射大鼠進(jìn)行干預(yù)， 結(jié)果表明：干預(yù)后8 d， EGCG+輻射組ABR閾值（38.1±3.3）dB低于輻射組的（49.4±8.6）dB， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;干預(yù)后8 d， EGCG+輻射組和輻射組的ABR閾值與干預(yù)前4 d的（19.3±5.5）、（21.0±3.7）dB對(duì)比明顯升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。輻射組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量降低， 形態(tài)改變， 排列雜亂不齊， 造模成功;EGCG+輻射組顯微鏡鏡檢表明耳蝸毛細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比有所降低， 排列較為雜亂， 但與輻射組相比形態(tài)結(jié)構(gòu)較好。對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1102.23±80.55）個(gè)， EGCG+輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（758.56±143.27）個(gè)， 輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為（527.00±165.23）個(gè)， EGCG+輻射組、輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于對(duì)照組， 輻射組耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)低于EGCG+輻射組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述， 對(duì)豚鼠預(yù)防性注射EGCG能夠有效降低電離輻射對(duì)聽(tīng)功能和耳蝸毛細(xì)胞損傷作用， 對(duì)電離輻射所致的聽(tīng)力損傷具有一定的防護(hù)作用。

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[收稿日期：2019-02-14]