湯 蜜，李沁蕓，李少斌,2，顏曉勇，余麗梅,2，楊亦彬,2

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室再生醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563099)

近年來(lái)大量國(guó)內(nèi)外研究強(qiáng)調(diào)了缺氧在慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)進(jìn)展中的重要性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)貫穿了糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，并認(rèn)為這種狀態(tài)與腎臟微血管病變以及局部新生血管生成密切相關(guān)[3-4]。一般情況下，機(jī)體可通過(guò)激活HIF/PHD軸上的缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)，進(jìn)而激活下游靶基因(血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)等，對(duì)缺氧做出適應(yīng)性應(yīng)答。但由于HIF半衰期短，易降解[5]，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)缺氧狀態(tài)下的緩沖儲(chǔ)備能力下降，可能是推進(jìn)DN進(jìn)展的主要原因之一。脯氨酸羥化酶(Proline hydroxylase ,PHD)作為HIF降解反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)HIF/PHD軸的HIF表達(dá)上有重要作用[6]。含羞草素是一種PHD廣泛抑制劑，可通過(guò)抑制PHD促進(jìn)HIF表達(dá)，改善機(jī)體腎氧平衡。本實(shí)驗(yàn)用含羞草素治療糖尿病大鼠，觀察含羞草素對(duì)糖尿病大鼠腎臟缺氧及HIF/PHD軸上的相關(guān)因子(HIF-1α、PHD2、HO-1)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 200～240g SD大鼠(由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所提供)，3～4月齡；共24只；鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、含羞草素 (Sigma公司)；小鼠抗大鼠HIF-1α單克隆抗體、兔抗大鼠PHD2多克隆抗體(NOVUS 公司)；小鼠抗大鼠HO-1單克隆抗體(Abcam 公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(ZSGB-BIO公司)；缺氧探針Hypoxyprobe?-1 Kit(HPI公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA引物、擴(kuò)增試劑盒(Sangon Biotech公司)；安穩(wěn)血糖儀(Sinocare 公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模分組及采樣 本實(shí)驗(yàn)由對(duì)照組、糖尿病組以及含羞草素治療組組成。采用腹腔注射STZ(55 mg/kg)模擬糖尿病模型，滿足：連續(xù)3d血糖>16.65 mmol/L、尿量>原尿量150%、尿蛋白排泄量>30 mg/24 h、尿糖強(qiáng)陽(yáng)性4項(xiàng)即為模型建立成功。對(duì)照組則注射同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。成模8周后，于次日上午9∶00～10∶00經(jīng)腹腔注射含羞草素(50 mg/kg/d，注射劑量為本課題組前期試驗(yàn)得出)作為含羞草素治療組。每組設(shè)12周末、16周末(從注射STZ開始計(jì)算)兩個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)，每個(gè)時(shí)點(diǎn)每個(gè)組4只大鼠。處死前留取24 h尿，并立即送檢24 h尿蛋白。心尖采血用于血糖檢測(cè)，將雙腎切為約3 mm厚的組織片，一部分用于制作石蠟切片；剩余組織裝入1.5 mL E管用于提取RNA；放入-80℃冰箱中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

1.2.2 血糖、尿蛋白 用安穩(wěn)血糖儀檢測(cè)各組大鼠血糖，檢驗(yàn)科檢測(cè)24 h尿蛋白。

1.2.3 腎組織常規(guī)病理 腎組織切片經(jīng)10%甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋后，在溫水中展平并用載玻片撈出，晾干后烘箱烤干備用。常規(guī)HE、PAS染色觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)。

1.2.4 腎組織免疫組織化學(xué)染色 取出經(jīng)石蠟包埋后的切片，脫蠟水化，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波爐加熱修復(fù)抗原，山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，滴加一抗 (抗體稀釋倍數(shù)：缺氧探針 1∶100、HIF-1α 1∶100、PHD2 1∶300 、HO-1 1∶100)，4℃過(guò)夜；滴加二抗， 37℃孵育30 min。PBS沖洗后經(jīng)過(guò)顯色、蘇木素復(fù)染、分化、中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察，選用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng) (Image-pro plus 6.0) 測(cè)定各組的平均積分光密度值(IOD)。

1.2.5 Real-Time PCR檢測(cè) 冰上提取腎組織總RNA并測(cè)定RNA純度及濃度，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行20 μL體系的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，2^(-△△Ct)法分析Ct值并計(jì)算RNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列：β-actin上游5'- AGCCATGTACGTTAGCCATCC -3'，下游5'- C TCTCAGCTGT GGTGGTGAA -3'；HIF-1α上游5'-TCAAGTCAGCAACGTGG AAG-3'，下游5'-TTCACAAATCA TCACCAAGC-3'；HO-1上游5'-C GAAACAAG CAGA ACCC AGT-3'，下游5'-TGT GTGGCTGGTGTGTAAGG-3'；PHD2上游5'- TGGAGACG GAAGATGTGTGA-3'，下游5'- CTTGGGTTCAATG TCAGCAA-3'。

2 結(jié)果

2.1 血糖、24 h尿蛋白 與NC組相比，DN組和DL組在兩時(shí)點(diǎn)的血糖、24 h尿蛋白水平均明顯升高(P<0.05)。DL組的血糖較模型組略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DL組24 h尿蛋白水平較DN組顯著降低(P<0.05，見表1)。

時(shí)間血糖(mmol/L)NCDNDL24 h尿蛋白(mg/24 h)NCDNDL12周6.15±3.0235.08±6.92△ 33.57±8.78△ 7.78±2.1247.70±9.63△23.74±7.94△★16周7.98±1.3543.71±4.06△ 50.93±5.31△☆ 7.52±2.4464.22±9.81△☆34.18±8.85△★

與NC 組比較 ΔP<0.05；與DN 組比較，★P<0.05；與 12周比較，☆P<0.05。

2.2 腎臟病理 腎臟病理PAS染色顯示NC組的腎臟組織未發(fā)現(xiàn)異常病變。而DN組和DL組均可見不同程度的腎小球增大，系膜基質(zhì)增多、部分腎小管及球囊擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞顆粒和空泡變性等病理改變，且DL組的病變相對(duì)于DN組有所減輕(見圖1)。

圖1 大鼠腎組織PAS染色結(jié)果(×400)

2.3 腎臟缺氧狀況及相關(guān)因子免疫組化

2.3.1 缺氧探針(HypoxyprobeTM-1) 3組缺氧探針染色均呈陽(yáng)性，NC組主要集中在髓質(zhì)及皮髓交界，而DN組擴(kuò)大到皮質(zhì)區(qū)。且DN組的陽(yáng)性著色面積顯著擴(kuò)大(P<0.05)，而DL組較DN組顯著縮小(P<0.05,見表2、圖2)。

時(shí)間NCDNDL12周12.59±0.9727.19±2.33△17.38±1.71△★16周11.30±1.3923.53±1.02△16.18±3.90△

與NC 組比較，ΔP<0.05；與DN 組比較，★P<0.05。

2.3.2 HIF-1ɑ、PHD2、HO-1的蛋白及mRNA表達(dá) 3個(gè)指標(biāo)均突出表達(dá)于腎小管。DN組、DL組腎臟HIF-1α、PHD2、HO-1蛋白和mRNA表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，除DN組16周時(shí)的HO-1蛋白、HIF-1α mRNA以及兩時(shí)點(diǎn)HO-1 mRNA表達(dá)上調(diào)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余時(shí)點(diǎn)DN組和DL組的指標(biāo)均顯著高于NC組(P<0.05)； DL組兩時(shí)點(diǎn)腎臟HIF-1α、PHD2、HO-1蛋白表達(dá)顯著高于DN組(P<0.05)，兩時(shí)點(diǎn)HIF-1α以及16周HO-1 mRNA表達(dá)也顯著高于DN組(P<0.05)(見表3、圖3～6)。

圖2 大鼠腎組織缺癢探針免疫組比(×400)

組別HIF-1α蛋白12周16周 PHD2 蛋白12周16周HO-1 蛋白12周16周NC14.21±7.3416.55±7.5224.89±3.8921.97±9.4528.43±8.1326.98±6.46DN88.05±9.07△39.81±6.88△☆89.83±19.98△68.28±20.34△101.60±32.21△49.71±14.45DL127.75±7.02△★ 95.62±12.53△★☆140.84±13.65△★ 121.77±8.37△★145.50±18.25△★129.07±17.85△★ 續(xù)表組別HIF-1α mRNA12周16周PHD2 mRNA12周16周HO-1 mRNA12周16周NC65.74±47.6675.72±32.5466.81±36.8761.83±26.8068.93±35.9065.49±35.02DN135.24±73.58△95.93±29.93200.42±42.28△ 154.35±74.73△120.40±81.9495.01±52.72DL260.20±59.77△★137.00±8.49△★217.11±62.81△191.27±21.34△162.16±31.73168.90±67.84△

與NC組比較，ΔP<0.05；與DN 組比較，★P<0.05；與12 周比較 ☆P<0.05。

圖3 大鼠腎組織HIF-1α免疫組比(×400)

圖4 大鼠PHD2免疫組比(×400)

圖5 大鼠腎組織HO-1免疫組比(×400)

圖6 大鼠腎組織β-actin、HIF-1α、PHD2、HO-1的擴(kuò)增、溶解曲線

3 討論

近年來(lái)，有研究提出“腎組織缺氧是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展到終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)的最終共同途徑”[7]。糖尿病腎病(DN)作為CKD和ESRD最主要的病因，其發(fā)病機(jī)制與腎組織缺氧狀態(tài)也密切相關(guān)[8]。HIF是介導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)缺氧最主要的轉(zhuǎn)錄因子，Zhang X等[9]的研究發(fā)現(xiàn)激活HIF能減輕DN中低氧誘導(dǎo)的組織損傷，延緩DN的進(jìn)展。表明HIF可能是DN的潛在治療靶點(diǎn)。

HIF主要由氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達(dá)的β亞基構(gòu)成。HIF-α家族包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF- 1α是缺氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[10]。在低氧條件下，α亞基(HIF-1α)與β亞基形成具有轉(zhuǎn)錄活性的異二聚體。然后HIF-1α被反式激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以結(jié)合HO-1和VEGF等缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia response element,HRE)，通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)，維持腎臟血氧平衡[8]。然而在常氧條件下，HIF受到脯氨酸羥化酶(PHD)的調(diào)控，易發(fā)生降解。Bohuslavova R等[11]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟處于低氧狀態(tài)時(shí)，HIF不能被充分激活。

含羞草素是一種從含羞草中提煉出的植物氨基酸，其副作用小，通常作為PHD的抑制劑發(fā)生效應(yīng)[12]。研究表明含羞草素能非選擇性地抑制PHD的所有同種型，使HIF-1a的表達(dá)增加[13]。Schellinger IN等[14]發(fā)現(xiàn)含羞草素可激活CKD大鼠腎臟組織HIF的表達(dá)，并能在后期顯著增加VEGF和EPO的表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)新生血管形成對(duì)抗缺氧。Müller等[15]發(fā)現(xiàn)在堆積大量糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)的糖尿病晚期，含羞草素能增加DN大鼠牙髓衍生細(xì)胞的促血管生成能力。鑒于以上研究，本課題組提出含羞草素可能改善糖尿病大鼠腎臟組織缺氧的猜想。

通過(guò)腹腔注射含羞草素干預(yù)糖尿病大鼠，利用缺氧熒光探針?lè)z測(cè)大鼠體內(nèi)的缺氧相關(guān)因子的表達(dá)從而評(píng)估各組大鼠腎臟缺氧狀況[16]。發(fā)現(xiàn)DN組和DL組大鼠在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎臟組織的缺氧面積均顯著高于NC組(P<0.05)，含羞草素治療后顯著減少(P<0.05)。另外，PAS染色結(jié)果顯示：DN大鼠兩時(shí)點(diǎn)的腎臟出現(xiàn)不同程度的腎小球增大、系膜基質(zhì)增多、腎小管擴(kuò)張等病理改變，含羞草素治療后改善。說(shuō)明糖尿病大鼠腎臟存在缺氧狀態(tài)，且含羞草素能一定程度的緩解其缺氧、改善腎組織病理?yè)p傷。另外，含羞草素改善腎臟缺氧的同時(shí)(P<0.05)，DL組兩時(shí)點(diǎn)腎臟HIF-1α和HO-1的蛋白、mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。由此我們推測(cè)含羞草素改善糖尿病大鼠缺氧的作用可能與調(diào)節(jié)HIF-1α下游靶基因HO-1的表達(dá)相關(guān)。Lever等[17]發(fā)現(xiàn)HO-1能減輕DN中由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的血管收縮、腎小球病變以及腎功能降低等損傷，具有腎臟保護(hù)作用。且HO-1的這些作用受到HIF調(diào)控。含羞草素能抑制PHD，上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，使HIF在機(jī)體缺氧狀態(tài)下被充分激活，HO-1隨之表達(dá)上調(diào)，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用[18]。

然而，含羞草素對(duì)HIF-1α的調(diào)節(jié)并不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中DL組大鼠HIF-1α的表達(dá)在16周較12周下調(diào)，但缺氧現(xiàn)象卻較12周減輕。說(shuō)明含羞草素雖能緩解腎臟缺氧狀態(tài)，但其對(duì)HIF的調(diào)節(jié)機(jī)制并不單一[19]。PHD作為HIF降解的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是接受低氧調(diào)控的HIF的下游靶基因[20]。盡管PHD在缺氧時(shí)功能低下，但有研究提出即使在缺氧狀態(tài)下，PHD2也能選擇性地促進(jìn)HIF-1α降解[21]。這也解釋了DN組大鼠在氧含量降低時(shí)，PHD2的蛋白和mRNA的表達(dá)反而較NC組升高的現(xiàn)象。

此外，DL組大鼠腎臟的PHD2蛋白和mRNA表達(dá)并未受到抑制，這似乎與含羞草素的作用相矛盾。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在不同的病理生理?xiàng)l件下，不同的PHD亞型調(diào)節(jié)不同的HIF-α亞型且作用強(qiáng)度不同；作為轉(zhuǎn)錄因子,不同的HIF-α亞型也調(diào)控著作用不同甚至功能相反的下游因子的轉(zhuǎn)錄[22]。由此可見，PHD抑制劑通過(guò)上調(diào)HIF的表達(dá)從而緩解腎臟缺氧的這一機(jī)制非常復(fù)雜。含羞草素調(diào)控HIF-1α的表達(dá)也可能并非完全通過(guò)PHD2這一亞型來(lái)完成。另外，HIF雖能有效的改善DN大鼠腎臟缺氧狀態(tài)，但HIF的大量激活也會(huì)加重腎組織纖維化[23]。結(jié)合本研究16周時(shí)的糖尿病大鼠處于DN的中晚期，使用含羞草素后， HIF-1α被大量激活，促進(jìn)了腎臟組織的纖維化，PHD2在此時(shí)表達(dá)上調(diào)是否歸因于機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，這需要進(jìn)一步深入研究。

總之，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含羞草素可以在一定程度上改善糖尿病大鼠腎臟組織缺氧和病理?yè)p傷，且該作用與上調(diào)HIF/PHD軸上的HIF-1α和HO-1的表達(dá)有關(guān)。這為含羞草素用于DN的臨床治療提供了基礎(chǔ)依據(jù)。