單芹麗,李紳崇,吳麗芳,余蓉培,李 帆,吳 旻,阮繼偉,汪國鮮*,楊春梅*

(1.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心，云南 昆明 650205)

非洲菊(Gerberahybrida)為菊科大丁草屬多年生宿根草本植物，是世界著名的五大鮮切花之一，屬異花授粉植物，基因型高度雜合[1-2]，品種間雜交后代的性狀分離廣泛[3]，造成非洲菊自交系的選育非常困難。常規(guī)雜交方法通常需要4～6代、花費6～7年的時間才能獲得純合的自交系[4]。通過胚珠培養(yǎng)誘導的非洲菊單倍體植株，經(jīng)染色體加倍培育成純合二倍體，可快速獲得自交系[5-6]。

筆者通過前期研究的積累，已培育出大量單倍體植株，結(jié)果表明：非洲菊單倍體開花植株與栽培品種雜合二倍體相比，株型較小[7-8]。因此，可根據(jù)開花植株的形態(tài)特征和生長特性鑒定出單倍體，通過考察和測定單倍體開花植株的園藝性狀，快速篩選具有目標性狀的非洲菊單倍體進行新品種培育。但非洲菊單倍體的組培苗生根較困難。目前，非洲菊的商業(yè)品種大部分為雜合二倍體[9]，前人在基因型、基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、外植體類型、附加物添加等因素對非洲菊雜合二倍體生根的影響已開展了相關研究[10-12]。但是，非洲菊單倍體植株生根的相關研究報道較少，缺乏系統(tǒng)性研究?；诖?，本試驗以非洲菊單倍體和雜合二倍體植株為材料，比較培養(yǎng)基成分對非洲菊單倍體和二倍體的開始生根時間、生根率、根數(shù)、根長、株高和鮮重影響的差異，探究培養(yǎng)基和基因型對單倍體植株生根的影響，篩選單倍體生根的最佳培養(yǎng)基，并進一步研究不同單倍體在相同培養(yǎng)基中的生根效果。通過了解非洲菊單倍體植株的生根情況，旨在為培育單倍體開花植株奠定基礎，推進非洲菊單倍體育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料來自云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所培育的組培繁殖苗，雜合二倍體R1由非洲菊品種紅極星花蕾誘導培育而來；單倍體qH1由非洲菊品種紅極星胚珠誘導培育而來，單倍體qQ6和qQ12由非洲菊品種秋日胚珠誘導培育而來，單倍體qW25由非洲菊品種白馬王子胚珠誘導培育而來，單倍體qY17由非洲菊品種陽光路胚珠誘導培育而來。以上試驗材料株系的繼代次數(shù)都已超過10次。

1.2 試驗設計

先以同一非洲菊品種來源誘導培育的雜合二倍體R1(花托誘導培養(yǎng)的再生植株)和單倍體qH1(胚珠誘導培養(yǎng)的再生植株)組培繁殖苗為材料，接種在4種(A、B、C、D)含不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的MS或1/2MS培養(yǎng)基中，試驗設計見表1。根據(jù)生根效果，篩選出非洲菊單倍體植株的最佳培養(yǎng)基后，再以不同單倍體株系qQ6、qQ12、qW25、qY17的組培繁殖苗為材料，接種在篩選的最佳培養(yǎng)基中。接種前稱量每瓶苗的鮮重，每個處理10瓶，將繁殖苗切成單株，株高保留1 cm左右，每瓶接種20個單株。所有培養(yǎng)基pH值為5.5～5.8，均添加食用白糖30 g/L、瓊脂7 g/L。置于溫度(22±2)℃，光照強度2000～2500 lx的培養(yǎng)室中，光照時間為10 h/d。

表1 試驗設計

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

培養(yǎng)期間，采用目測方法，每天定時觀察1次，記錄每個處理根系開始萌發(fā)的時間。培養(yǎng)25 d后，每個處理中隨機抽取未污染的4瓶(4次重復)，稱量鮮重，計算每株苗鮮重增加速度，調(diào)查株高、生根率、根長、根數(shù)，計算每瓶苗各測量參數(shù)的平均值。

生根率=生根株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100。

單株鮮重增加速度/(mg/d)=(調(diào)查時每株苗的鮮重-接種前每株苗的鮮重)/培養(yǎng)天數(shù)。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和DPS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用Duncan’s新復極差法對各處理進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 非洲菊單倍體和二倍體的生根培養(yǎng)比較

2.1.1 不同培養(yǎng)基中單倍體和二倍體根系的萌發(fā)時間及生根率比較 同一非洲菊品種來源誘導培育的單倍體和二倍體組培繁殖苗，在4種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，各處理的根系萌發(fā)時間和生根率見圖1。單倍體開始生根需要的時間顯著比二倍體長，單倍體根系萌發(fā)時間需要13.8～15.3 d，二倍體根系萌發(fā)時間需要9～11.8 d。非洲菊植株在4種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，單倍體和二倍體在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)的根系開始萌發(fā)所需時間最短，即1/2MS基本培養(yǎng)基中在添加IBA 0.4 mg/L和NAA 0.3 mg/L的培養(yǎng)基有利于根系萌發(fā)。在1/2MS和MS基本培養(yǎng)基中添加相同配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，倍性相同的處理5和處理7、處理6和處理8的根系萌發(fā)時間差異不顯著，說明基本培養(yǎng)基的濃度對根系萌發(fā)時間影響不大，但植物生長調(diào)節(jié)劑配比的種類和濃度對單倍體和二倍體根系誘導所需時間存在顯著影響。

同一品種來源誘導培育的非洲菊單倍體和雜合二倍體在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d后，單倍體的平均生根率在77.5%～98.8%，二倍體的平均生根率在86.3%～100%。除培養(yǎng)基C外，其他3種培養(yǎng)基對單倍體和二倍體生根率的影響存在顯著差異，并且單倍體的生根率較二倍體的生根率低。在培養(yǎng)基C中培養(yǎng)的二倍體和單倍體生根率都較高，說明培養(yǎng)基C既適宜二倍體生根，也適宜單倍體生根。

圖1 單倍體和二倍體在不同培養(yǎng)基中根系萌發(fā)時間和生根率比較

2.1.2 培養(yǎng)基對單倍體和二倍體根長及根數(shù)的影響 單倍體和二倍體在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d后，各處理間的根長和根數(shù)均存在顯著差異(圖2)。4種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的單倍體根長均短于二倍體根長，其中在培養(yǎng)基C適于植株長根，二倍體平均根長為2.3 cm，單倍體平均根長為1.7 cm。

培養(yǎng)25 d后，在培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D中誘導的單倍體根數(shù)比二倍體根數(shù)少，而在培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基C誘導的單倍體根數(shù)比二倍體根數(shù)多。二倍體在培養(yǎng)基A中誘導的根數(shù)最多，平均根數(shù)可達7.7條；單倍體在培養(yǎng)基B中誘導的根數(shù)最多，平均根數(shù)可達9.9條。

圖2 培養(yǎng)基對單倍體和二倍體根長及根數(shù)的影響

2.1.3 培養(yǎng)基對單倍體和二倍體株高及鮮重增加速度的影響 單倍體在表1中的4種培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d后，株高顯著低于二倍體的株高，鮮重增加速度顯著慢于二倍體的鮮重增加速度(圖3)。二倍體在培養(yǎng)基D中的株高最高，為4.5 cm；單倍體在培養(yǎng)基C和培養(yǎng)基D中的株高最高，且2個處理間的差異不顯著，株高均為3.5 cm。二倍體在培養(yǎng)基B和培養(yǎng)基C中的鮮重增加速度較最快，每株植株每天鮮重的增加量平均分別為18.7 mg和19.3 mg；單倍體鮮重增加速度在不同培養(yǎng)基中的差異不顯著，每株植株每天鮮重的增加量為10.3～12.0 mg。

2.2 不同非洲菊單倍體株系的生根培養(yǎng)比較

將同一非洲菊品種來源誘導培育的單倍體和二倍體組培繁殖苗接種在表1所列的4種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，除鮮重增加速度外，各處理株高、生根率、根長和根數(shù)存在顯著差異，說明培養(yǎng)基對單倍體生根效果有顯著影響。結(jié)果見圖1、圖2和圖3。綜合各測量指標結(jié)果，篩選出適宜非洲菊單倍體生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.4 mg/L+NAA 0.3 mg/L(培養(yǎng)基C)。

圖3 培養(yǎng)基對單倍體和二倍體株高及鮮重增加速度的影響

5種單倍體在篩選的最佳培養(yǎng)基C中培養(yǎng)，各處理間根系萌發(fā)時間、生根率、根長、根數(shù)、株高和鮮重增加速度存在顯著差異，說明基因型對單倍體生根效果有顯著影響。單倍體根系開始萌發(fā)時間12～15 d，培養(yǎng)25 d后，根長1.1～1.7 cm、株高2.6～3.7 cm、生根率85%～98.8%、根數(shù)8.1～10.1條、鮮重增加速度11.0～12.6 mg/d(表2)。

表2 不同單倍體株系的生根培養(yǎng)結(jié)果

注：小字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性，字母相同則差異不顯著，不同則顯著。

3 討論

單倍體育種技術是獲得純系材料行之有效的生物技術育種方法，近年來備受育種家關注。由于非洲菊單倍體長勢較弱[7]，加之單倍體的加倍率相對較低[13]，限制了非洲菊單倍體在育種研究中的實踐和應用。提高非洲菊單倍體的生根效果，能提升單倍體植株在育種研究中的應用價值。在植物組培技術研究中，生根率、根長和生根數(shù)一般是生根環(huán)節(jié)需考察的重要指標，而我們認為：根系開始萌發(fā)時間、株高和鮮重增加速度在提升種苗質(zhì)量和節(jié)約生產(chǎn)成本方面具有舉足輕重的作用，也應該列為生根環(huán)節(jié)考察的重要指標。為此，本試驗將上述6項指標定為非洲菊單倍體生根培養(yǎng)研究的測量參數(shù)。

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎,植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關鍵物質(zhì)[14],植物生長調(diào)節(jié)劑對植株生長發(fā)育起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用[15]。IBA主要是通過轉(zhuǎn)化為IAA而起作用，常常用來誘導試管苗生根[16]，我們采用本團隊常用的非洲菊生根培養(yǎng)基MS+IBA 0.4 mg/L，對10個非洲菊單倍體株系進行初步生根培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)所有株系生根率不到50%，部分單倍體株系甚至不生根。前人研究認為培養(yǎng)基1/2MS誘導非洲菊的生根效果優(yōu)于MS和1/4MS，并且1/2MS附加濃度為0.05～0.1 mg/L的NAA誘導生根所需時間最短，誘導率高達100%[10]。IBA濃度相同時，配組不同濃度NAA對試管苗的生根數(shù)、平均根長和新生葉片數(shù)影響較大；NAA濃度相同時，配組不同濃度的IBA對根的形態(tài)影響較小[11]。

本試驗是根據(jù)前人的研究結(jié)果，結(jié)合我們前期的初步試驗，在此基礎上，通過對非洲菊單倍體在不同培養(yǎng)基中進一步做生根培養(yǎng)試驗，篩選出適宜非洲菊單倍體生根的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.4 mg/L+NAA 0.3 mg/L。結(jié)果表明：培養(yǎng)基和基因型對單倍體生根效果存在顯著影響。采用1/2MS培養(yǎng)基或添加適宜濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑NAA，可顯著提高單倍體的生根率，使單倍體的生根率達77.5%以上；在1/2MS和MS基本培養(yǎng)基中添加相同配比植物生長調(diào)節(jié)劑，單倍體的根系萌發(fā)時間和株高差異不顯著，相同單倍體在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鮮重增加速度差異也不顯著，除此以外，處理間各參數(shù)的測量結(jié)果均存在顯著差異。培養(yǎng)25 d后，在培養(yǎng)基A和D中誘導的單倍體根數(shù)比二倍體根數(shù)少，而在培養(yǎng)基B和C中誘導的單倍體根數(shù)比二倍體根數(shù)多。