阮 穎，鄭 洪，劉華慶，黃佳佳，譚 娜，王 凱

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。我國宮頸癌發(fā)病率15/10萬，近年來發(fā)病趨勢明顯年輕化，且早期患者增多[2]。隨著醫(yī)學(xué)分子技術(shù)的發(fā)展以及對表觀遺傳學(xué)的重視，發(fā)現(xiàn)抑癌基因的異常甲基化可導(dǎo)致目的基因及調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄失活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[3]。配對盒家族基因 1(Paired box gene 1，PAX1)是一種重要的抑癌基因，PAX1 甲基化抑制細(xì)胞分化，可影響宮頸癌前病變的病理進(jìn)程[4]。PAX1蛋白是一類非常保守的轉(zhuǎn)錄因子，它在機(jī)體發(fā)育和疾病中有著重要的作用[5]。然而，少有文獻(xiàn)對PAX1甲基化與蛋白表達(dá)在宮頸鱗癌及上皮內(nèi)病變的臨床病理學(xué)意義進(jìn)行報(bào)道，本研究旨在分析PAX1甲基化與其蛋白檢測在宮頸鱗癌及上皮內(nèi)病變中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2014年1月至2018 年 10月存檔的320例宮頸病變患者石蠟標(biāo)本。根據(jù)病理診斷結(jié)果將其分為慢性宮頸炎癥(組Ⅰ，93 例)、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(組Ⅱ， 20 例)，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(組Ⅲ， 112 例)及宮頸鱗癌(組Ⅳ，95例)。鱗癌組標(biāo)本包括Ⅰ期73例，Ⅱ期22例；按病理分型：角化型54例，非角化型41例；按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：陽性27例，陰性68例；按有無復(fù)發(fā)分為：陽性7例，陰性88例。以上標(biāo)本術(shù)前均未曾行放療、化療及免疫治療，所有活檢標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林液固定，切片HE染色后由專業(yè)病理醫(yī)師參照2014年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[6]。

1.2 研究方法

1.2.1 PAX1甲基化檢測 首先提取石蠟樣本DNA，用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA(BisDNA)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測PAX1甲基化狀態(tài)做定性分析， 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作并進(jìn)行判讀。陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)：目的基因CT值≤ 20情況下，目的基因CT值<內(nèi)標(biāo)基因CT值，或者內(nèi)標(biāo)基因無擴(kuò)增曲線；目的基因CT值>內(nèi)標(biāo)基因CT值 ，△CT≤4。陰性判讀標(biāo)準(zhǔn)：目的基因無擴(kuò)增曲線，或者目的基因CT值>內(nèi)標(biāo)基因CT值，且△CT>4(△CT=目的基因CT值-內(nèi)標(biāo)基因CT值)。 PAX1甲基化上游引物，5'-GCGGTGATAGTGGTTGAGGAG-3'，PAX1非甲基化上游引物，5'-GTGGTGATAGTGGTTGAGGAGTATATG-3'，PAX1甲基化下游引物，5'-GGAGTGATTGGTTTATAATTTTTGG-3'，PAX1甲基化探針，F(xiàn)AM-CGGAGGTTTCGATTTT TTTGTTTTCGTT-BHQ1，PAX1非甲基化探針，VIC-GGTTGTGGAGGTTTTGATTTTTT TGTTTTTG-BHQ2。反應(yīng)體系：10 μL甲基化MIX+5 μL引物探針混合液+5 μL BisDNA=20 μL總量。反應(yīng)條件：第一步95℃ 5 min，循環(huán)1次；第二步95℃ 15 s，66℃ 30 s，各循環(huán)20次；第三步95℃ 10 s，62℃ 31 s，各循環(huán)40次，最后收集熒光信號。

1.2.2 PAX1蛋白檢測 PAX1抗體購于英國 Abcam公司，參照說明書選取人胃癌石蠟組織作陽性對照預(yù)實(shí)驗(yàn)，獲得PAX1一抗的最適濃度比例為1∶200，運(yùn)用免疫組織化學(xué)Envision法檢測，采用檸檬酸鈉緩沖液高壓鍋修復(fù)，操作步驟按說明書進(jìn)行。PBS緩沖液代替一抗作空白對照。結(jié)果判定：PAX1蛋白的表達(dá)位于細(xì)胞核，以胞核染成黃棕色或黃褐色均勻顆粒狀為陽性細(xì)胞。 參照同類PAX蛋白判讀標(biāo)準(zhǔn)[7]，高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，其中細(xì)胞核內(nèi)無著色計(jì)0分、細(xì)胞核內(nèi)見淺黃色顆粒計(jì) 1 分、細(xì)胞核內(nèi)見棕黃色顆粒計(jì)2分、細(xì)胞核內(nèi)見棕褐色顆粒計(jì)3分；染色細(xì)胞比例不足10%計(jì)0分 、10%～25%計(jì)1分 、>25%～50%計(jì)2分、>50%計(jì)3分，以細(xì)胞核著色強(qiáng)度、染色細(xì)胞比例乘積>3分為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組患者PAX1甲基化水平比較 本次研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀作甲基化定性分析，其4組的部分樣本PAX1甲基化擴(kuò)增曲線(見圖1)。宮頸組織的甲基化率隨病變程度的加重而增高，鱗癌組最高，4組比較差異顯著。進(jìn)行組間兩兩對比顯示，鱗癌組、高級別、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組分別與慢性炎癥組差異明顯；鱗癌組、高級別與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；鱗癌組與高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。

A：組Ⅰ；B：組Ⅱ；C：組Ⅲ；D：組Ⅳ。圖1 4組部分樣本PAX1甲基化qRT-PCR擴(kuò)增曲線

表1PAX1甲基化檢測在宮頸組織中的甲基化率情況 (n，%)

組別例數(shù)甲基化例數(shù) (%)χ2P慢性炎癥931(1.08)低級別鱗狀上皮內(nèi)病變 205(25.00)?164.673<0.001高級別鱗狀上皮內(nèi)病變11274(66.07)?#鱗癌9585(89.47)?#&

兩兩比較時(shí)經(jīng)矯正檢驗(yàn)水準(zhǔn)α’=0.05/[k(k-1)/2]≈0.008，k為比較組數(shù)，*：本組與慢性炎癥組比較P<0.008，#：本組與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組比較P<0.008，&：本組與高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組比較P<0.008。

2.2 PAX1甲基化率與臨床病理特征的關(guān)系 在宮頸鱗癌組織中，PAX1甲基化率與患者年齡、病理分型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與患者復(fù)發(fā)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2PAX1甲基化率在宮頸鱗癌組織中的甲基化情況與臨床及病理參數(shù)的比較(n)

臨床病理特征例數(shù)陽性陰性χ2 P 年齡≤50 635580.3770.539>50 32302病理分型角化型544770.3030.582非角化型41383淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無686170.0001.000有27243有無復(fù)發(fā)無88817-0.024?有743

*：為Fisher確切概率法的結(jié)果。

2.3 4組患者PAX1蛋白表達(dá)情況比較 PAX1蛋白在慢性宮頸炎組織中低表達(dá)，隨著宮頸病變程度的加深，表達(dá)逐漸增強(qiáng)(見圖2)。宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組PAX1蛋白陽性表達(dá)率最高，然而鱗癌組表達(dá)率有所降低，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行組間兩兩對比顯示，鱗癌組、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組與慢性炎癥組差異明顯，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3)。

A：組Ⅰ； B：組Ⅱ；C：組Ⅲ；D：組Ⅳ；SP，×400。圖2 4組患者 PAX1 蛋白表達(dá)

表3PAX1蛋白檢測在宮頸組織中的陽性表達(dá)情況(n，%)

組別總例數(shù)陽性例數(shù) (%)χ2P慢性炎癥931(1.08)低級別鱗狀上皮內(nèi)病變2014(70.00)?240.907<0.001高級別鱗狀上皮內(nèi)病變112108(96.43)?#鱗癌9585(89.47)?

兩兩比較時(shí)經(jīng)矯正檢驗(yàn)水準(zhǔn)α’=0.05/[k(k-1)/2]≈0.008，k為比較組數(shù)，*：本組與慢性炎癥組比較P<0.008，#：本組與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組比較P<0.008。

2.4 PAX1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 在宮頸鱗癌組織中，PAX1蛋白的表達(dá)與患者年齡、病理分型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)(P>0.05，見表4)。

表4PAX1蛋白陽性表達(dá)在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況與臨床及病理參數(shù)的比較(n)

臨床病理特征例數(shù)陽性陰性χ2 P 年齡≤50 635942.2730.132>50 32266病理分型角化型545132.1740.140非角化型41347淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無6858103.0140.083有27270有無復(fù)發(fā)無88808-0.158?有752

*：為Fisher確切概率法的結(jié)果。

2.5 PAX1甲基化與蛋白檢測的關(guān)聯(lián)性 4組患者發(fā)生PAX1甲基化總例數(shù)為165例，PAX1蛋白陽性表達(dá)總例數(shù)為208例，兩者同時(shí)陽性133例，同時(shí)陰性80例，進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析顯示兩種檢測方法之間存在關(guān)聯(lián)性(χ2=36.468，P<0.05)，其關(guān)聯(lián)強(qiáng)度φ=0.338。此外，4組患者總PAX1甲基化率為51.56%(165/320)，PAX1蛋白的總陽性率65.00%(208/320)，兩種方法陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.882，P<0.05，見表5)。

表5兩種檢測方法的結(jié)果比較 (n)

PAX1甲基化檢測PAX1蛋白檢測+-合計(jì)+13332165-7580155合計(jì)208112320

3 討論

PAX基因家族是一組重要的發(fā)育調(diào)控基因家族，其在胚胎發(fā)育和器官形成中發(fā)揮重要作用[8]。在脊椎動物中共有9個(gè)成員(Pax1—Pax9)，編碼的蛋白質(zhì)屬于螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白，分布于細(xì)胞核，是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的調(diào)控，在胚胎發(fā)育過程中對細(xì)胞分化、更新、凋亡等均起重要調(diào)控作用[8]。研究表明PAX基因的異常表達(dá)會導(dǎo)致多種器官組織發(fā)育畸形,某些癌癥的發(fā)生也與其中的一些成員過量表達(dá)有關(guān)[5]。PAX1是PAX 基因家族中的一員，由一個(gè)配對域(Paired domain， PD) 和一個(gè)八肽域(Octapeptide，OP) 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，主要參與骨骼的發(fā)育調(diào)控轉(zhuǎn)錄，是細(xì)胞分化關(guān)鍵基因，也是一種重要的抑癌基因，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[9]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道PAX1在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，本文主要研究PAX1甲基化與蛋白檢測在宮頸鱗癌及上皮內(nèi)病變的臨床病理學(xué)意義及關(guān)聯(lián)性。

3.1 PAX1甲基化檢測在宮頸鱗癌及上皮內(nèi)病變中的價(jià)值分析 新近研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌變過程包括諸多基因及表觀遺傳與調(diào)控基因的改變[10]，其中DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)改變已成為目前研究熱點(diǎn)，該過程主要表現(xiàn)為腫瘤抑制基因的啟動子區(qū)域發(fā)生異常，導(dǎo)致目的基因及調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄失活，進(jìn)而促使腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。此外，DNA甲基化可以通過各種分子檢測技術(shù)精確地測量，例如，MSP、焦磷酸測序、亞硫酸氫鹽測序、以及各種基于芯片深度測序的全基因組方法[11]，此次研究采用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀作定性檢測，其優(yōu)點(diǎn)在于：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單、操作簡便、檢測時(shí)間快、靈敏度高且費(fèi)用低廉，適用于大量樣本的檢測[12]。這對于我國一些經(jīng)濟(jì)比較落后的地區(qū)，實(shí)用性相對比較理想。對不同分組癌前病變與宮頸鱗癌分別進(jìn)行PAX1甲基化檢測后，證實(shí)PAX1基因在宮頸鱗癌標(biāo)本中存在異常甲基化，其甲基化率高達(dá)89.47%，與宮頸慢性炎癥組織及癌前病變存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，隨著宮頸病變程度的加重，甲基化率呈上升趨勢，這與Xu 等[8]的研究報(bào)道一致。通過對宮頸鱗癌組進(jìn)行臨床病理參數(shù)對比發(fā)現(xiàn)，PAX1甲基化與年齡、病理分型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床病理特征無明顯相關(guān)(P>0.05)，但與患者復(fù)發(fā)相關(guān)，推測PAX1的甲基化可能與患者疾病進(jìn)展相關(guān)聯(lián)，可以判斷病變預(yù)后情況，對宮頸癌患者治療的預(yù)后評估可能具有指導(dǎo)意義。

3.2 PAX1蛋白檢測在宮頸鱗癌及上皮內(nèi)病變中的價(jià)值分析 為了探討PAX1在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測其從宮頸慢性炎癥到惡性腫瘤的整個(gè)過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：宮頸慢性炎癥組織中僅在副基底層見散在陽性顆粒細(xì)胞，隨宮頸病變程度的加重陽性區(qū)域面積逐漸增大，鱗癌組最高，然而，PAX1蛋白表達(dá)在鱗癌組表達(dá)有所下降，宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組最高，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=244.668，P<0.05)；進(jìn)行組間兩兩對比顯示，鱗癌組、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組與慢性炎癥組差異明顯，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.008)。在鱗癌組，PAX1蛋白的表達(dá)與患者年齡、病理分型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)無明顯差異(P>0.05)，這與Liu等[13]研究PAX1蛋白在子宮內(nèi)膜癌的臨床病理特征相似。綜上，PAX1蛋白檢測有助于高級別與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變的鑒別，且其在癌組的表達(dá)與臨床病理特征無明顯相關(guān)性。

3.3 PAX1甲基化與蛋白檢測的關(guān)聯(lián)性分析 研究發(fā)現(xiàn)不同組別存在甲基化患者的蛋白檢測結(jié)果幾乎為陽性表達(dá)，僅少部分未甲基化患者的蛋白檢測結(jié)果仍為陽性表達(dá)；4組患者PAX1甲基化率為51.56%，PAX1蛋白表達(dá)的總陽性率65.00%，兩種方法陽性率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=11.882，P<0.05)，PAX1蛋白的表達(dá)高于其甲基化率。進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析顯示兩種檢測方法之間存在關(guān)聯(lián)，其關(guān)聯(lián)強(qiáng)度φ=0.338，結(jié)合表1、表3結(jié)果PAX1甲基化及蛋白表達(dá)隨病變程度加重總體呈上升趨勢，說明PAX1甲基化與PAX1蛋白表達(dá)具有正相關(guān)性，PAX1甲基化作為表觀遺傳學(xué)修飾形式的改變，PAX1甲基化并沒有下調(diào)其蛋白的表達(dá)，而PAX1蛋白發(fā)生其功能與其甲基化之間的相互作用具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PAX1甲基化率隨宮頸病變程度加深逐漸增高，且與宮頸鱗癌復(fù)發(fā)相關(guān)，推測PAX1甲基化可能與患者疾病進(jìn)展相關(guān)聯(lián)，有助于判斷病變預(yù)后情況；PAX1蛋白檢測有助于宮頸高級別與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變鑒別，且在宮頸鱗癌的表達(dá)與臨床病理特征無明顯關(guān)聯(lián)；PAX1甲基化與PAX1蛋白表達(dá)隨宮頸病變程度的加重總體呈上升趨勢，PAX1甲基化與其蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。