曹 琦，陳 蕾，李 穎，胡 瓊，董生鳳

(1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，天津 西青 300380；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，貴州 遵義 563099)

早產(chǎn)(Preterm birth,PTB)指妊娠滿28周至不滿37周的分娩[1]。全世界上的發(fā)生率約為5%至18%，這是一種常見的妊娠并發(fā)癥并且有增加趨勢[2]。因此，對感染性早產(chǎn)的防治越來越受到大家的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦體內(nèi)的免疫細胞可分泌多種細胞因子，構(gòu)建成母胎界面(蛻膜和子宮組織)復雜的細胞因子網(wǎng)絡，維持著母胎免疫平衡[3]。輔助性T細胞17(T helper 17 cells,Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)是CD4+T免疫細胞群中重要的細胞亞群，Th17是強有力的致炎細胞，與其所分泌的炎性細胞因子共同參與炎性疾病的發(fā)生[2]。Treg細胞在妊娠時可抑制母體對胎兒的免疫殺傷反應，而維持著妊娠的發(fā)生發(fā)展。本研究對Th17細胞和Treg細胞在感染性早產(chǎn)孕婦外周血中的表達情況進行檢測，目的在于探討其作為早期預測感染性早產(chǎn)發(fā)生新指標的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗取材 收集2017年12月至2018年12月遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院40例早產(chǎn)(28～36+6周)患者的外周血。這些早產(chǎn)患者產(chǎn)前均無干預措施，年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。根據(jù)胎盤病檢結(jié)果再分為早產(chǎn)感染組(24例)和早產(chǎn)非感染組(16例)。20名正常足月入院的孕婦作為足月待產(chǎn)組，均除外妊娠期合并癥及并發(fā)癥。收集上述3組孕婦靜脈血5 mL，肝素抗凝。本研究所有操作均符合醫(yī)學倫理學，并經(jīng)遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會及患者本人同意。

1.1.2 主要試劑 PE-抗人IL-17A單克隆抗體、FITC-抗人CD4單克隆抗體、APC-抗人CD25單克隆抗體、APC-抗人CD3單克隆抗體、FITC-抗人CD8a單克隆抗體、PE-抗人FoxP3單克隆抗體、PE-鼠lgG1同型對照均購自美國eBioscience公司；Transcription Fsctor Buffer Set購自美國BD公司；PMA+Ionomycin淋巴細胞刺激物、BFA工作液、RPMI1640培養(yǎng)基等。

1.2 方法

1.2.1 白細胞懸液制備 取1mL全血于試管中加入3倍體積紅細胞裂解液，震蕩搖勻，4℃放置15 min，待細胞裂解。1 500 rpm，離心5 min，棄上清，收集細胞。向白細胞沉淀中加入2 mL紅細胞裂解液，1 500 rpm，離心5 min，棄上清，收集細胞。用360 μL PBS重懸細胞。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測Th17細胞 吸取300 μL全血與同體積RPMI1640培養(yǎng)基，放置于24孔板中。在標本中加入刺激劑和阻斷劑，混勻細胞。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激4～6 h。流式上樣管中分別加入5 μL CD3-APC單克隆抗體、5 μL CD8a-FITC單克隆抗體，吸取200 μL培養(yǎng)好的樣本加入流式管中，4℃避光孵育30 min，之后用PBS洗滌細胞2次。加入破膜劑，再次室溫避光孵育40～50 min，1 500 rpm，4℃離心6 min，棄上清。重懸細胞后加入5 μL IL-17A-PE單克隆抗體進行充分混勻，并設(shè)立對照管，4℃避光孵育40～50 min。用PBS洗滌2次后，加入1%多聚甲醛400 μL固定細胞，于4℃避光保存24 h，F(xiàn)ACS calibur流式細胞儀檢測，計算CD4+T細胞中Th17細胞所占的百分比。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測Treg細胞 吸取之前制備的白細胞懸液100 μL加入流式上樣管中，分別加入5μL CD4-FITC單克隆抗體、5μL CD25-APC單克隆抗體，渦旋震蕩細胞，4℃避光孵育30 min。加入2 mL PBS清洗細胞1次，1 000 rpm，離心5 min，棄上清。加入破膜劑，再次室溫避光孵育40～50 min，1 500 rpm，4℃離心6 min，棄上清。重懸細胞后加入5 μL PE anti-Human Foxp3單克隆抗體進行充分混勻，并設(shè)立對照管，4℃避光孵育40～50 min。用PBS洗滌2次后，加入1%多聚甲醛400μL固定細胞，避光4℃保存24 h，F(xiàn)ACS calibur流式細胞儀檢測，計算CD4+T細胞中Treg細胞所占的百分比。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 早產(chǎn)感染組、早產(chǎn)非感染組、足月待產(chǎn)組的年齡、孕次比較差異均無統(tǒng)計學意義，但3組孕周比較差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，用Pearson簡單相關(guān)系數(shù)分析孕周與外周血中Treg細胞、Th17細胞數(shù)量的相關(guān)性，結(jié)果提示無相關(guān)(P>0.05)，可以進行后續(xù)實驗，詳見表1。

表13組孕周與外周血Treg、Th17細胞的相關(guān)性

臨床指標早產(chǎn)感染組孕周rP早產(chǎn)非感染組孕周rP足月待產(chǎn)組孕周rPTreg0.0120.978-0.1670.7520.0940.811Th17-0.3570.345-0.4630.3550.040.926

2.2 Th17、Treg細胞在外周血中的表達 早產(chǎn)感染組中Th17細胞陽性率明顯高于早產(chǎn)非感染組、足月待產(chǎn)組(P<0.01)；Treg細胞陽性率明顯低于早產(chǎn)非感染組、足月待產(chǎn)組(P<0.01)；早產(chǎn)非感染組和足月待產(chǎn)組中Th17、Treg細胞陽性率無顯著差異(P>0.05，見表2、圖1～2)。

組別例數(shù)Th17陽性率(%)Treg陽性率(%)早產(chǎn)感染240.640±0.063?#0.048±0.014?#早產(chǎn)非感染160.350±0.0490.634±0.136足月待產(chǎn)200.340±0.0980.670±0.109

與早產(chǎn)非感染組相比，*：P<0.05；與足月待產(chǎn)組相比，#：P<0.05。

圖1 流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞中Th17細胞陽性率

圖2 流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞中Treg細胞陽性率

3 討論

在所有不同類型早產(chǎn)中，感染性早產(chǎn)的發(fā)生率居于首位，其病因復雜，發(fā)病機制不明，是圍產(chǎn)兒患病、死亡的重要原因，給家庭及社會帶來巨大的心理、社會負擔[4]。明確感染性早產(chǎn)的發(fā)病機制，針對其發(fā)病機制尋找有效的實驗預測指標，便于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，對降低感染性早產(chǎn)的發(fā)生，具有重要的臨床意義。Th17細胞和Treg細胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群，越來越多的證據(jù)表明Th17、Treg細胞作為效應細胞和調(diào)節(jié)細胞參與妊娠的建立和維持，其失衡可能導致妊娠失敗[5]。

Th17細胞作為新發(fā)現(xiàn)的效應細胞參與妊娠的建立和維持[6]。然而，尚未見報道其對感染性早產(chǎn)的預測作用。本研究中，早產(chǎn)感染組外周血中Th17細胞陽性率表達升高，表明Th17細胞在感染性早產(chǎn)孕婦體內(nèi)高表達，對妊娠過程中的免疫平衡起到負調(diào)節(jié)作用。促進中性粒細胞動員、募集、激活，巨噬細胞吞噬病原體等活動一直被認為是Th17細胞發(fā)揮促炎作用的主要機制[7]。因而，造成感染性早產(chǎn)的免疫機制可能是：機體被細菌、病毒等病原體攻擊后，Th17細胞刺激體內(nèi)免疫細胞啟動免疫應答，導致體內(nèi)Th17/Treg細胞免疫平衡向Th17細胞方向移動，機體內(nèi)Th17細胞陽性率增加，促使炎性細胞因子IL-17A表達增多并直接作用于白介素-17受體A(Interleukin‐17 receptor A，IL-17RA)，促進中性粒細胞和巨噬細胞等增殖和成熟，并將其募集到感染部位，通過這些細胞的活化及相關(guān)炎性介質(zhì)釋放后形成的炎癥級聯(lián)反應(Inflammatory cascade)，介導外源性細菌感染及促炎作用，提前發(fā)動分娩[8-9]。

在本研究中，感染性早產(chǎn)組Treg細胞的陽性率顯著低于其它兩組，說明Treg細胞在感染性早產(chǎn)孕婦體內(nèi)表達降低，對妊娠過程中的免疫平衡起積極正調(diào)節(jié)作用，有利于妊娠維持。其原因可能是：正常妊娠期間，Treg細胞被募集到母胎界面，調(diào)節(jié)局部抗炎微環(huán)境，幫助在母體與胎兒之間形成免疫耐受，維持妊娠的發(fā)展[10]。當有微生物侵襲并形成炎癥時，炎性介質(zhì)刺激免疫細胞分化成Th17細胞，使得Treg細胞在免疫細胞中比例降低，細胞外環(huán)境中的抗炎細胞因子表達降低[11]。一方面使Treg細胞不能發(fā)揮針對胎兒和母體間免疫排斥的高效免疫抑制功能；另一方面，沒有足夠的抗炎因子來抑制Th17細胞的增殖和分化，無法有效地抑制促炎細胞因子IL-17A等的表達。Th17細胞及其細胞因子將胎兒視為異體移植物或外來病原體發(fā)動免疫攻擊，這種自身免疫過度，可導致感染性早產(chǎn)的發(fā)生。比較3組Treg細胞陽性率，發(fā)現(xiàn)非感染性早產(chǎn)和足月分娩孕婦體內(nèi)表達無明顯差異，與Th17細胞陽性率的比較結(jié)果相似。進一步表明Th17/Treg免疫失衡確實僅與感染性早產(chǎn)的分娩機制有關(guān)，而對非感染性早產(chǎn)和正常分娩的影響微弱。

感染性早產(chǎn)的發(fā)生機制目前尚無準確的結(jié)論，對其預測及治療方法有限，本實驗通過對Th17、Treg細胞數(shù)量的比較，發(fā)現(xiàn)當發(fā)生感染性早產(chǎn)時，孕婦母胎免疫界面的Th17/Treg細胞平衡發(fā)生偏移。因此，對Th17/Treg細胞平衡的動態(tài)監(jiān)測，有望成為預測感染性早產(chǎn)的新指標，但仍需進一步擴大樣本量驗證。