廖劍雄，張一馳，王炳今,張 謙，劉維佳

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099 ；2.貴州省人民醫(yī)院 燒傷整形科，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴州省人民醫(yī)院急診內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550002；4.貴州省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 貴州 貴陽(yáng) 550002)

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是以肺動(dòng)脈壓力和肺小血管阻力進(jìn)行性增加為特征的臨床-病理生理綜合征，主要表現(xiàn)為肺血管過(guò)度收縮、肺小動(dòng)脈重構(gòu)，從而引起肺血管阻力的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)肺動(dòng)脈壓力的逐漸升高，最終導(dǎo)致右心衰死亡。PH的形成中以肺小動(dòng)脈重構(gòu)是主要環(huán)節(jié)，而在肺血管重構(gòu)過(guò)程中又以炎癥反應(yīng)及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)異常增殖為中心環(huán)節(jié)[1]，然而近年來(lái)IL-6及GATA-6在炎癥反應(yīng)及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增殖中的作用受到高度關(guān)注。目前全球約有1億人受到PH的威脅，由于治療效果差和疾病不可逆性的迅速進(jìn)展，其死亡率居高不下[2-3]。所以進(jìn)一步研究PH的發(fā)病機(jī)制，探討其治療新靶點(diǎn)具有重要意義。為此本研究采用野百合堿(MCT)成功誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，探討IL-6與GATA-6在肺動(dòng)脈高壓中表達(dá)及意義，為確定肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MCT購(gòu)于美國(guó)MCE公司(批號(hào)：Lot#35488)；IL-6一抗(山羊抗大鼠)購(gòu)于美國(guó)R&D公司(批號(hào)：AF506)；二抗(兔抗山羊)購(gòu)于康為世紀(jì)(批號(hào)：CW0105s)；PageRulerTMPlus Prestained Protein Ladder購(gòu)于美國(guó)THERMO公司(批號(hào)：00459134)；PCR引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；Ultrapure RNA Kit購(gòu)于康為世紀(jì)公司(批號(hào)50250)；HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit購(gòu)于美國(guó)Vazyme公司(批號(hào)7E220E8)；酚：氯仿：異戊醇25∶24∶1購(gòu)于Solarbio公司生產(chǎn)(批號(hào)：P1012)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠54只，體重250～300 g，第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物飼養(yǎng)由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)，本研究已通過(guò)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核(編號(hào):2018-001)，所有操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范。大鼠籠盒飼養(yǎng)，保持環(huán)境溫度25℃，濕度60%～70%，自由進(jìn)食、飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為3組，分別是生理鹽水對(duì)照組(A組，n=18)，空白對(duì)照組(B組，n=18)，MCT組(C組，n=18只)。 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(黔)2018-0001)

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒓皺z測(cè)時(shí)間點(diǎn)確認(rèn) 上述大鼠自由飼養(yǎng)1周后于造模前1天取無(wú)水乙醇：生理鹽水2∶8比例將MCT溶解稀釋配置成1%MCT溶液37℃過(guò)夜，C組18只大鼠于造模當(dāng)天取配置完成的MCT按60 mg/kg單次腹腔內(nèi)注射。 A組18只大鼠于造模當(dāng)天將0.9%NaCl按60mg/kg單次腹腔內(nèi)注射。B組18只大鼠不做任何處理。記造模當(dāng)天為第一日，于造模后第7天(T1)、第14天(T2)、第21天(T3)共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)每次分別從A組、B組、C組大鼠中各隨機(jī)取6只做實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 右心導(dǎo)管法測(cè)右心室壓力 根據(jù)文獻(xiàn)右心室平均壓力可反映肺動(dòng)脈平均壓力[4]。于造模后T1、T2、T3分別取各組大鼠6只，手術(shù)前禁食8h，10%水合氯醛(0.04 mL/kg)腹腔注射麻醉，將PE10管預(yù)充肝素鹽水采用右心導(dǎo)管法經(jīng)右側(cè)頸外靜脈插管至右心室，用BL-420S生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn))檢測(cè)右心室壓力，并計(jì)算右心室平均壓力。

1.5 稱重法計(jì)算右心室肥厚指數(shù) 大鼠分別于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)完右心室壓力后均斷頭處死開胸后完整取出心臟，剪去左右心房及心耳，在肺動(dòng)脈出口處剪開右心室游離壁組織(RV)，其余則為左心室(LV)+室間隔組織(S),洗去血污,吸干水分,然后分別稱重,按公式右心肥厚指數(shù)=RV/[LV+S]計(jì)算。

1.6 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 檢測(cè)右心室壓力后，取肺組織用生理鹽水通過(guò)肺動(dòng)脈沖洗剩余的血液，放入4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、封片。在數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)下對(duì)切片進(jìn)行圖像采集及分析。

1.7 Western Blot檢測(cè)肺組織IL-6蛋白表達(dá)水平 稱取適量肺組織，RIPA裂解液與PMSF體積比按99∶1混勻，充分裂解組織，冰上孵育20 min后，12 000 rpm離心10 min，收集上清。根據(jù)BAC蛋白試劑盒測(cè)各樣本蛋白濃度，垂直電泳后，轉(zhuǎn)膜2h，封閉20 min，IL-6一抗4℃過(guò)夜(稀釋度1∶1 000)，兔抗山羊?yàn)槎故覝胤跤? h(稀釋1∶2 000)，設(shè)β-actin為內(nèi)參(稀釋度1∶5 000)，ECL發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，膠片曝光。采用Gel-Pro analyzer4圖像分析軟件測(cè)定各條帶的灰度值做定量分析。

1.8 Real-time PCR檢測(cè)肺組織GATA-6表達(dá)水平 Trizol 法提取樣本肺組織細(xì)胞總RNA，引物設(shè)計(jì)：上游5'CCCAGCGCAGACCTGTTGGAGGACC3',下游5'TGTGACAGTTGGCACAGGACAG3'；β-actin：上游5'TTGCTGACAGGATGCAGAAG3',下游5'TAGAGCCACCAATCCACACA3'；按照HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit步驟操作，50℃逆轉(zhuǎn)錄3 min，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s， 60℃退火30 s， 72℃ 延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。計(jì)算2-△△CT值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化見圖1。

A、B：A組和B組大鼠肺組織：可見組織小動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)清晰，小動(dòng)脈周圍未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；1C:C組T1大鼠肺組織：可見組織小動(dòng)脈壁厚薄不均，平滑肌細(xì)胞胞核形狀不規(guī)則，小動(dòng)脈周圍水腫；2C：C組T2大鼠肺組織：可見組織小動(dòng)脈形狀不規(guī)則，周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)成環(huán)，小動(dòng)脈壁被炎性細(xì)胞侵蝕；3C：C組T3大鼠肺組織：平滑肌細(xì)胞胞核固縮深染，小動(dòng)脈周圍可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)成環(huán)，肺水腫明顯，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞；HE×100。圖1 肺組織HE染色

2.2 MCT誘導(dǎo)SD大鼠右心室平均壓增高 與A組和B組比較，C組T1～T3右心室平均壓力明顯增高(P<0.05)；A組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組中T1～T3右心室平均壓力呈遞增性變化，于T3達(dá)到最高峰(P<0.05，見表1)。

2.3 MCT誘導(dǎo)SD大鼠右心室肥厚指數(shù)增高 與A組和B組比較，C組T1～T3右心室肥厚指數(shù)明顯增高(P<0.05)；A組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組中T2與T1比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，與T2和T1比較，T3明顯增高且達(dá)到最高峰(P<0.05，見表2)。

組別T1T2T3A12.41±2.8212.66±2.8712.93±0.63B11.71±2.4913.20±1.5211.47±1.50C18.72±0.77ab24.50±1.81abc34.28±3.55abcdF19.2348.3096.42P0.0010.0000.000

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

組別T1T2T3A 0.199±0.0070.198±0.0080.224±0.018B 0.193±0.0060.203±0.0150.204±0.008C 0.232±0.008ab0.235±0.150ab0.326±0.076abcdF 52.3314.3212.46P 0.0010.0000.001

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

2.4 MCT誘導(dǎo)SD大鼠肺組織IL-6水平增高 與A組和B組比較，C組IL-6表達(dá)在T1～T3時(shí)明顯增高(P<0.05)；A組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組中T2與T1比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與T2和T1比較，T3明顯增高且達(dá)到最高峰(P<0.05，見表3、圖2)。

組別T1T2T3A 0.02±0.010.02±0.010.03±0.01B 0.02±0.010.03±0.010.03±0.01C 0.08±0.01ab0.08±0.01ab0.17±0.01abcdF 71.9943.52344.86P 0.000.000.00

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

圖2 各時(shí)間點(diǎn)蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果

2.5 MCT誘導(dǎo)SD大鼠肺組織GATA-6 mRNA水平降低 與A組和B組比較，C組GATA-6的表達(dá)在T1～T3時(shí)明顯降低(P<0.05)；A組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組中T2與T1比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與T2和T1比較，T3明顯降低且達(dá)到最小峰(P<0.05，見表4)。

組別T1T2T3A 1.02±0.091.01±0.071.03±0.08B 0.98±0.051.03±0.061.01±0.07C 0.54±0.05ab0.48±0.04ab0.30±0.02abcdF 92.90165.42279.64P 0.000.000.00

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

2.6 C組中IL-6與GATA-6相關(guān)分析 C組中IL-6與GATA-6呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.887，P<0.05，見圖3)。

肺組織中IL-6表達(dá)水平圖3 IL-6與GATA-6相關(guān)分析

3 討論

PH發(fā)生時(shí) PASMC周圍的免疫細(xì)胞不斷積累，導(dǎo)致大量的炎癥介質(zhì)釋放，其中IL-6被認(rèn)為是炎癥介質(zhì)中最重要的靶點(diǎn)之一[5]。在人體通過(guò)檢測(cè) PH患者肺組織中IL-6的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其水平顯著升高，且單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6越多，動(dòng)脈重構(gòu)越迅速[6]。在未經(jīng)肺動(dòng)脈高壓造模的小鼠中，IL-6 的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致小鼠形成PH[7]，而IL-6基因敲除鼠在低氧誘導(dǎo)下未能形成肺動(dòng)脈壓力升高和肺血管重構(gòu)[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad2信號(hào)通路對(duì)維持血管正常結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)平衡起到重要作用，而該通路任意一個(gè)環(huán)節(jié)異常均可促進(jìn)肺血管重構(gòu)，其機(jī)制與在TGF-β1及Smad2刺激下PASMC內(nèi)IL-6增加有關(guān)[9-10]。最新研究顯示，在PH的形成中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2) 對(duì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)起到重要作用，一方面活化的ERK1/2可以通過(guò)ERK1/2-NF-κB信號(hào)通路激活NF-κB來(lái)促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，另一方面IL-6又可以通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路激活鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白酶(calpain)來(lái)促進(jìn)肺小動(dòng)脈重構(gòu)[11-12]。本研究結(jié)果顯示在給予MCT后，肺HE染色可見T1～T3，C組大鼠肺組織逐步出現(xiàn)小動(dòng)脈壁厚薄不均，平滑肌細(xì)胞胞核固縮深染，肺水腫，肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而A組和B組未見明顯改變，同時(shí)與A組、B組相比C組大鼠在T1～T3右心室平均壓力及右心室肥厚指數(shù)均明顯增高，且在C組中T1～T3右心室平均壓力及右心室肥厚指數(shù)呈遞增性變化并在T3達(dá)到最高峰，提示本研究PH模型建立成功，在此基礎(chǔ)上本研究發(fā)現(xiàn)與A組、B組相比C組大鼠IL-6表達(dá)在T1～T3明顯增高且C組中IL-6表達(dá)于T3明顯增高并達(dá)到最高峰。證實(shí)了IL-6在PH形成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時(shí)提示其表達(dá)的強(qiáng)弱可以作為評(píng)估PH病情程度的一個(gè)重要指標(biāo)。

GATA-6是唯一表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞的GATA家族轉(zhuǎn)錄因子，在肺組織其作用為抑制PASMC進(jìn)入細(xì)胞周期，維持靜止期PASMC表型的穩(wěn)定[13]，所以推測(cè)GATA-6通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞表型來(lái)抑制PASMC異常增殖可能具有重要意義。在一項(xiàng)肺癌細(xì)胞的研究中觀察到，刺激GATA-6的高表達(dá)能提高細(xì)胞存活率，而抑制GATA-6的表達(dá)可以明顯減低細(xì)胞的存活率[14]，進(jìn)一步證實(shí)GATA-6可以抑制細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，能保持靜止期細(xì)胞表型的穩(wěn)定性?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，GATA-6的下調(diào)能明顯提高肺動(dòng)脈壓力，在MCT大鼠模型中觀察到損傷后第3天起肺中的GATA-6 表達(dá)便迅速下降，表明GATA-6的低表達(dá)可能是引起肺動(dòng)脈高壓中血管重構(gòu)的早期病理過(guò)程[15]。本研究顯示，隨著PH的進(jìn)展，與A組、B組比較C組大鼠GATA-6的表達(dá)在T1～T3明顯降低且C組中GATA-6的表達(dá)于T3明顯降低并達(dá)到最小峰。與上述研究結(jié)果趨勢(shì)一致，表明GATA-6在PH的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，隨著PH的逐步進(jìn)展，IL-6的表達(dá)呈持續(xù)性升高，而GATA-6的表達(dá)呈持續(xù)降低，將C組中IL-6與GATA-6行相關(guān)分析結(jié)果顯示呈顯著負(fù)相關(guān)，提示IL-6與GATA-6在PH的發(fā)生發(fā)展中具有明顯相關(guān)性。

綜上所述，在肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中IL-6的表達(dá)明顯增高，GATA-6的表達(dá)明顯減低，且兩者在PH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并推測(cè)IL-6與GATA-6有明顯的相關(guān)性，但其機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。