湯 婭，石 蓓，趙然尊

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

心肌梗死(Myocardial infarction,MI)發(fā)生于冠狀動(dòng)脈閉塞，是最常見的心血管疾病之一，發(fā)病率和死亡率極高，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡、瘢痕形成、心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙和心功能減退。一般來(lái)說(shuō)，心肌細(xì)胞屬于不可再生細(xì)胞，已損傷的心肌細(xì)胞不可恢復(fù)其功能，即使藥物干預(yù)也不能使其恢復(fù)[1]。在規(guī)定的時(shí)間窗內(nèi)恢復(fù)心肌的血流對(duì)于逆轉(zhuǎn)心肌損傷的進(jìn)展和減輕心肌梗死面積的擴(kuò)大是至關(guān)重要的。然而，再灌注本身可能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，這大大削弱了其治療效果，并進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能惡化。

近年來(lái)，干細(xì)胞治療是缺血性心臟病的一種有前景的治療方法，包括胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs) 、心臟祖細(xì)胞(Cardiac progenitor cells,CPCs)及間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在內(nèi)的多種干細(xì)胞在心肌梗死中的治療潛能已被逐漸證實(shí)[2]。在這些細(xì)胞中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived-mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能和較強(qiáng)的自我更新能力，且取材方便，免疫原性低，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)的理想候選細(xì)胞。BMSCs治療MI已被證明是一種很好的基于細(xì)胞治療策略[3]。已有研究證明，BMSCs通過(guò)減少纖維化、促進(jìn)血管生成，在缺血損傷后改善心功能、延緩心臟重構(gòu)等方面發(fā)揮重要作用[4-5]。此外，大量研究表明，BMSCs移植能有效減輕心肌損傷，改善心功能。然而，由于供體細(xì)胞的生存能力較差，干細(xì)胞移植治療效果受到很大的限制[6-7]。BMSCs在缺血缺氧環(huán)境中容易發(fā)生凋亡，阻礙了其在細(xì)胞治療中的作用發(fā)揮[8-9]；缺血心肌中嚴(yán)酷的宿主缺血微環(huán)境可加速細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步損害了移植供體干細(xì)胞的存活并影響功能的發(fā)揮[10]。因此，提高移植供體細(xì)胞存活率和保留時(shí)間是增強(qiáng)BMSCs介導(dǎo)的心肌梗死治療效果的關(guān)鍵[11]。

核因子相關(guān)因子-2(Nuclear factor-E2-Related Factor 2，Nrf2)是機(jī)體抗氧化反應(yīng)的重要因子，其活化后可以激活下游多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，這些基因包括血紅素氧化酶-1(HemeOxygenase-1，OH-1)、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和硫氧還蛋白等。通過(guò)與細(xì)胞核中的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，調(diào)節(jié)廣泛的抗氧化酶、II相解毒酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的組成和誘導(dǎo)表達(dá)，激活抗氧化酶基因和解毒酶活性，保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化和親電應(yīng)激[12]。在本研究中，通過(guò)慢病毒在BMSCs中過(guò)表達(dá)Nrf2，觀察氧化應(yīng)激狀態(tài)下BMSCs的凋亡情況，同時(shí)探討過(guò)表達(dá)Nrf2對(duì)BMSCs的保護(hù)作用是否通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4周齡Spreagne-Dawley(SD)大鼠，雌雄不拘，體重40～50 g，由重慶騰鑫動(dòng)物公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005。

1.1.2 試劑 慢病毒載體Nrf2基因購(gòu)自北京合生基因科技有限公司；APC標(biāo)記小鼠抗大鼠CD90 抗體、PE標(biāo)記小鼠抗大鼠CD45 抗體(BioLegend公司)；兔抗大鼠Nrf2抗體、兔抗大鼠NQO1抗體、兔抗大鼠HO-1抗體、兔抗大鼠GAPDH、羊抗兔多克隆抗體IgG (博士德)；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(澳大利亞MRC公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基、 0.25%胰蛋白酶、 青霉素(10 000 U/mL)/鏈霉素(10 000 μg/mL)(美國(guó)Hyclone公司)；凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技公司)。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜、孵箱、酶標(biāo)儀(型號(hào)ELx800)(賽默飛)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge)；顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(貝克曼)； 高壓消毒鍋(TOMY)；-20℃冰箱(青島海爾)；紫外分光光度儀(TU1810)(譜析儀器廠)；超低溫冰箱(-80℃)(Forma Scientic)；MILLI-Q蒸餾水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；蛋白質(zhì)變性加熱器(蘇州海貍公司)；圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死大鼠，75%酒精浸泡10 min，無(wú)菌條件下取出股骨及脛骨，以2%新潔爾滅沖洗2次，移入超凈臺(tái)，無(wú)菌條件下剝離肌肉及筋膜；4%青霉素(10 000 U/mL)/鏈霉素(10 000 μg/mL清洗兩遍，剪開骨骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器抽取普通低糖DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集單細(xì)胞懸液，1 200 rpm離心5 min，棄上清，加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS及1%雙抗)，接種于T25培養(yǎng)瓶中，于5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)；24 h后進(jìn)行首次全量換液，以后每3～4天換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此后每3～4天傳代1次，第三代及以后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SD大鼠BMSCs的流式細(xì)胞術(shù)表型鑒定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代細(xì)胞，0.25%胰酶消化，收集單細(xì)胞懸液，1 200 rpm離心5 min，收集上清，平均分為3管，向每管細(xì)胞(100 μL)中分別加入CD45-PE、CD90-APC抗體各5 μL ，室溫避光孵育2 h；流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本課題組前期對(duì)大鼠BMSCs提取及鑒定實(shí)驗(yàn)[13-14]， CD29、CD90流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度分別為99.3%、99.5%，CD45為1.3%，故只進(jìn)行了CD90、CD45的流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

1.2.3 SD大鼠BMSCs的Nrf2慢病毒載體轉(zhuǎn)染 各組慢病毒載體購(gòu)自北京合生基因科技有限公司；取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代BMSCs，隨機(jī)分為5組， Control組、Nrf2-Vector組、si-Nrf2組、Nrf2-Scramble組、LV-Nrf2組；轉(zhuǎn)染病毒之前，加入3 μL 10 mg/mL的Polybrene共培養(yǎng)30 min，后加入MOI為150的病毒量，感染后12 h換回常規(guī)完全培養(yǎng)基，分別于感染48 、72 h用顯微鏡觀察病毒熒光表達(dá)情況，同時(shí)采用Western Blot驗(yàn)證Nrf2轉(zhuǎn)染成功。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)探討H2O2模擬氧化應(yīng)激環(huán)境的最佳濃度及時(shí)間 通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，得知300 μmol/L H2O2處理4 h為誘導(dǎo)BMSCs氧化應(yīng)激的最佳濃度及時(shí)間[15]。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代BMSCs，分別以0、100、200、300、400 μmol/L H2O2處理4 h(n=3)，消化離心后收集細(xì)胞；加入5 μL A nnexin V-FITC混勻后，加入10 μL Propidium Iodide(PI)，混勻；室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)要求結(jié)束后，消化離心收集細(xì)胞；余步驟同1.2.4。

1.2.6 Western blot檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染Nrf2后Nrf2、HO-1及NQO1的表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總蛋白。10%的SDS-PAGE分離膠進(jìn)行電泳，PVDF電轉(zhuǎn)，5%的脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST洗膜。與一抗結(jié)合(兔抗大鼠Nrf2 1∶300、兔抗大鼠NQO1 1∶500、兔抗大鼠HO-1 1∶500、兔抗大鼠GAPDH 1∶300)， 4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜，二抗孵育1 h(羊抗兔多克隆抗體IgG 1∶5000)；ECL顯色：按照說(shuō)明書用移液槍以A、B兩種發(fā)光液按1∶1的比例混勻并均勻滴在PVDF膜上，用Image Lab凝膠成像系統(tǒng)曝光獲得成像圖片；使用Image Pro Plus軟件對(duì)圖片上每個(gè)特異性條帶灰階度進(jìn)行數(shù)字化分析。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠BMSCs形態(tài)學(xué)鑒定 培養(yǎng)第3天，細(xì)胞有觸角伸出，細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈多角形、棱形，少部分呈現(xiàn)條索狀，細(xì)胞為成簇狀團(tuán)狀生長(zhǎng)，胞漿內(nèi)有顆粒狀結(jié)構(gòu)分布。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，原代細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%，即可開始傳代培養(yǎng)。傳代后細(xì)胞進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，第3代細(xì)胞形態(tài)均一，呈魚群狀、漩渦狀生長(zhǎng)(見圖1)。

2.2 SD大鼠BMSCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定 第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD90陽(yáng)性表達(dá)(97.18%)，而CD45弱表達(dá)(3.36%，見圖2)。

2.3 BMSCs成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)Nrf2 慢病毒感染BMSCs 48h后，熒光顯微鏡下可見少量綠色熒光表達(dá)，感染72h后，絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光(見圖3，對(duì)照組圖略)。故當(dāng)MOI=150時(shí)，綠色熒光表達(dá)最強(qiáng)且細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，表明慢病毒可成功將Nrf2基因轉(zhuǎn)染至BMSCs，且絕大部分細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，WB驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功，滿足本實(shí)驗(yàn)的要求(見圖4)。

A、B、C、D分別為P0～P3培養(yǎng)細(xì)胞。圖1 倒置顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)

圖2 流式鑒定P3MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物

A: 48 h；B:72 h。圖3 倒置顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染BMSCs

2.4 H2O2模擬BMSCs氧化應(yīng)激環(huán)境的最佳濃度及時(shí)間確定 不同濃度的H2O2(0、100、200、300、400μmol/L)處理BMSCs4h后收集細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡(見圖5)。結(jié)果顯示， 300μmmol/L組處理BMSCs 4h凋亡率顯著上調(diào)(P<0.05)且大部分細(xì)胞為早期凋亡，同時(shí)死亡細(xì)胞量較少。因此選定300μmmol/L H2O2處理BMSCs 4 h作為誘導(dǎo)BMSCs凋亡的最佳濃度和時(shí)間，用于體外模擬心肌梗死后氧化應(yīng)激微環(huán)境。

a：與Control組相比較，P<0.05；b：與Control組相比較，P<0.001；n=3。圖4 WB檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后Nrf2水平

a：與100μmmol/L組比較，P<0.05；b：與300μmmol/L組比較，P<0.001；c：與200μmmol/L組比較，P<0.001；n=3。圖5 不同濃度H2O2誘導(dǎo)BMSCs氧化應(yīng)激模型

2.5 過(guò)表達(dá)Nrf2降低氧化應(yīng)激狀態(tài)下BMSCs的凋亡 Control組、Nrf2-Vector組、si-Nrf2組、Nrf2-Scramble組以及LV-Nrf2組，BMSCs總體凋亡率分別為68.52%±0.04、60.94%±0.02、89.22%±0.02、62.22%±0.01、38.99%±0.06；與Control組相比，si-Nrf2組BMSCs總體凋亡率顯著上調(diào)(P<0.05)，抑制BMSCs中Nrf2表達(dá)可促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)BMSCs凋亡。相反，與Control組相比， LV-Nrf2組BMSCs的總體凋亡率顯著降低(P<0.05)，過(guò)表達(dá)BMSCs中Nrf2降低H2O2誘導(dǎo)的BMSCs凋亡(見圖6)。

a：與Control組相比較，P<0.001；b：與Control組相比較，P<0.001；n=3。圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

2.6 過(guò)表達(dá)Nrf2提升BMSCs抗氧化蛋白HO-1、NQO1水平 與Control組相比，LV-Nrf2組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)Nrf2可以促進(jìn)BMSCs內(nèi)抗氧化蛋白的表達(dá)；相反，與Control組相比，si-Nrf2組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，說(shuō)明敲除Nrf2可以抑制BMSCs內(nèi)抗氧化蛋白的表達(dá)；此外，與Control組相比，Nrf2-Vector組、Nrf2-Scramble組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯改變(P>0.05，見圖7)。

a：與Control組相比較，P<0.001；b：與Control組相比較，P<0.001； n=3。圖7 WB檢測(cè)Nrf2、 HO-1、NQO1的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

心肌梗死(MI)是最常見的急性心臟損傷，常常導(dǎo)致心力衰竭，近年來(lái)，干細(xì)胞移植作為心臟再生和心臟修復(fù)的一種新方法正在興起，具有取代傳統(tǒng)方法的潛力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)因具有易于獲得、可快速擴(kuò)增、無(wú)倫理爭(zhēng)議和免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，在異基因移植中受到廣泛關(guān)注[16]。大量研究表明，BMSCs移植能有效減輕心肌損傷、改善心功能，但確切的分子機(jī)制尚不清楚[6-7]。雖然基于BMSCs的心肌梗死治療已在動(dòng)物和臨床得到證實(shí)，但對(duì)移植BMSCs的體內(nèi)追蹤顯示，只有少數(shù)BMSCs在宿主心臟內(nèi)保留和存活，而大多數(shù)移植的BMSCs發(fā)生凋亡和衰老，喪失再生活性[17-18]，BMSCs移植后低“歸巢”率、低存活率和低分化率嚴(yán)重制約了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在臨床上的應(yīng)用。因此，如何提高移植BMSCs的保留和存活，抑制細(xì)胞凋亡和衰老，是提高移植BMSCs治療效果的關(guān)鍵。有研究者發(fā)現(xiàn)，基因修飾可有效提高移植BMSCs的存活率；鄧寧波等[19]證實(shí)人血紅素加氧酶1 修飾的大鼠BMSCs對(duì)缺血缺氧環(huán)境損傷的耐受能力明顯增強(qiáng)。此外，陳少?gòu)?qiáng)等人發(fā)現(xiàn)慢病毒載體可介導(dǎo)外源性基因SDF-1α在大鼠BMSCs中高效表達(dá)，并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和遷移[20]。故本實(shí)驗(yàn)使用慢病毒載體介導(dǎo)Nrf2在BMSCs中高表達(dá)，從而提高移植BMSCs的抗凋亡能力。

基因修飾可分為病毒載體修飾和非病毒載修飾，而目前較為常用的病毒載體包括慢病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體，其中慢病毒載體不僅可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞，且表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、低免疫原性、安全性高、轉(zhuǎn)染效率高以及可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，在心血管疾病、癌癥及神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面被廣泛的應(yīng)用[21]，所以本實(shí)驗(yàn)選用自我失活的慢病毒質(zhì)粒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染BMSCs，建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Nrf2及沉默Nrf2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系，促進(jìn)移植BMSCs的歸巢率及存活率。

真核細(xì)胞通過(guò)激活Nrf2來(lái)對(duì)抗氧化和其他環(huán)境壓力，Nrf2是治療各種炎癥和氧化相關(guān)健康疾病的潛在治療靶點(diǎn)；Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路被認(rèn)為是一種新型的氧化信號(hào)通路，具有抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等多種功能[22]。前期不少研究表明，在各種氧化應(yīng)激狀態(tài)下，激活Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路可有效增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力[23-27]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Nrf2作為目的基因，探討過(guò)表達(dá)Nrf2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響。在本研究中，我們?cè)噲D闡明Nrf2轉(zhuǎn)染到BMSCs在氧化應(yīng)激環(huán)境下抗凋亡的可能機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，LV-Nrf2組BMSCs的總體凋亡率顯著降低(P<0.05)，抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1、NQO1相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；si-Nrf2組BMSCs總體凋亡率顯著升高(P<0.05)； si-Nrf2組抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1、NQO1相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，表明慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs在氧化應(yīng)激狀態(tài)下具有更好的抗凋亡能力，并且極有可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Nrf2慢病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力比單純BMSCs效果更強(qiáng)，而Nrf2慢病毒沉默后的BMSCs對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力比單純BMSCs效果更弱．說(shuō)明Nrf2增強(qiáng)了BMSCs對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的能力，其機(jī)制可能是Nrf2轉(zhuǎn)染BMSCs后激活了Nrf2及其下游的抗氧化蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)BMSCs的作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)Nrf2可有效減少氧化應(yīng)激狀態(tài)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)激活Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路，調(diào)節(jié)Nrf2、HO-1及NQO1的活性有關(guān)。