李沅衡，蘇 歡，蔡思琪，盧 巍，莫鎮(zhèn)濤，蔣振東，劉 寧，楊 琳

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，廣東 珠海 519000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 藥理學(xué)教研室，廣東 珠海 519000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 護(hù)理學(xué)教研室，廣東 珠海 519000)

創(chuàng)面愈合是各種致傷原因造成組織損傷后依賴機(jī)體再生及修復(fù)功能完全或部分恢復(fù)相應(yīng)結(jié)構(gòu)及功能的過程[1]。隨著糖尿病等慢性疾病發(fā)病率的不斷增長，機(jī)體自身創(chuàng)面愈合能力及愈合速度均有所下降，皮膚作為人體最大的器官是機(jī)體重要保護(hù)防線，當(dāng)其出現(xiàn)損傷或缺失時(shí)不及時(shí)予以治療措施可能導(dǎo)致瘢痕愈合甚至感染，嚴(yán)重影響皮膚正常結(jié)構(gòu)及功能[2-4]。莫匹羅星是臨床上治療皮膚破損感染最常見的藥物之一，但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)類創(chuàng)面耐藥菌感染已成為阻礙創(chuàng)面愈合最主要的原因之一[5]。杉木是我國南方重要造林樹種，其作為優(yōu)良的速生用材樹種，材質(zhì)輕柔、結(jié)構(gòu)勻稱、耐腐性強(qiáng)[6]。民間有報(bào)道使用杉木碎屑外敷急性創(chuàng)傷傷口，具有快速止血和收斂傷口作用，并可用于治療跌打損傷、過敏性皮炎等[7]。相關(guān)研究顯示，杉木提取物對多種病原微生物有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌等[8]有較強(qiáng)的抑制作用。因此，杉木提取物在臨床外用輔助創(chuàng)面修復(fù)有著一定的臨床價(jià)值，但相關(guān)報(bào)道研究較少[9]。本研究將杉木提取物與藥用輔料卡波姆有效地結(jié)合成凝膠劑，通過比較不同濃度杉木及莫匹羅星對SD大鼠皮膚創(chuàng)面愈合能力的影響，探究杉木提取物凝膠對創(chuàng)面修復(fù)治療的優(yōu)勢，為臨床利用杉木提取物輔助創(chuàng)面修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及菌種 SD大鼠32只，雌雄各半，體重200g±20g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0002，飼養(yǎng)于普通級動物房內(nèi)，溫度(22±2)℃，相對濕度40%～60%，12 h光照、12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)。金黃色葡萄球菌購自上海魯微科技有限公司，菌種編號CMCC(B)26003、大腸埃希菌購自上海魯微科技有限公司，菌種編號ATCC25922。本實(shí)驗(yàn)動物處理方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)， 并經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(HeidolphHei-VAP，Precision，德國)；自動脫水機(jī)(ASP300S，Leica，德國)；自動包埋機(jī)(TB-718E，Leica，德國)；石蠟切片機(jī)(RM2255，Leica，德國)；光學(xué)顯微鏡(6BX43，Olympus，日本)；電動攪拌機(jī)、真空泵、回流冷凝裝置各一套。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 杉木干(取自貴州省畢節(jié)市)；無水乙醇(廣東光華科技股份有限公司)；卡波姆940(上海麥克林生化科技有限公司)；HE試劑盒(北京雷根生物有限公司)；甘油(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；苯甲酸鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；三乙醇胺(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；二甲苯(廣東光華科技股份有限公司)；HE染料(北京雷根生物有限公司)；莫匹羅星軟膏(上海景宏生物科技有限公司)；營養(yǎng)肉湯(廣東環(huán)凱微生物有限公司)；瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 杉木原液提取 將杉木的芯材置于干燥箱中，在105 ℃下烘至恒重后，用刨片機(jī)刨成薄片待用。稱取薄片置于圓底燒瓶中，用75%乙醇浸泡3 h后，利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮提取。按照料液比1∶5(g/mL)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)3 h后，得到濃縮液體，分裝后置于4 ℃冰箱中待用。

1.4.2 杉木凝膠劑制備 稱取0.75g卡波姆(型號940)于25g甘油中充分浸潤研磨，待溶脹后，分別量取杉木提取物濃縮溶液20 mL和稀釋一倍后同體積的濃縮液加入其中，滴加配置好的1%苯甲酸鈉1 mL和15%三乙醇5 mL，充分?jǐn)嚢韬笫蛊涑蔀槟蹱?，最后獲得杉木提取物0.2 g/mL高劑量凝膠(原濃縮液濃度)和0.1g/ml低劑量凝膠(稀釋1倍后的濃縮液濃度)，分裝后置于4℃冰箱待用。

1.4.3 創(chuàng)面動物模型構(gòu)建 采用10%水合氯醛0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，脫毛后利用滅菌手術(shù)剪在大鼠背部脫毛區(qū)制作半徑1.8 cm的機(jī)械性全層皮膚創(chuàng)面，面積約達(dá)10.2 cm2，創(chuàng)面呈圓形，達(dá)深筋膜。大鼠致傷后分籠飼養(yǎng)，創(chuàng)面制作后不做處理，待清醒后于高壓滅菌墊料中單籠飼養(yǎng)。

1.4.4 給藥方式 將造模成功的創(chuàng)傷大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，給藥方法分別為：陰性對照組創(chuàng)面不予以處理；陽性對照組創(chuàng)面采用莫匹羅星軟膏0.1 g進(jìn)行處理；低劑量組創(chuàng)面用杉木提取物低劑量凝膠0.1 g；高劑量組創(chuàng)面用杉木提取物高劑量凝膠0.1 g。涂藥時(shí)將藥物覆蓋于創(chuàng)面上，每24 h給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

1.4.5 抑菌試驗(yàn) 采用打孔器將濾紙制成6 mm小圓片，高壓滅菌后分別浸泡于低劑量杉木原液、高劑量杉木原液、莫匹羅星溶液及生理鹽水中各1 h，自然風(fēng)干后貼附于接種細(xì)菌的培養(yǎng)基平板上，其中金黃色葡萄球菌平板與大腸埃希菌平板各5個(gè)，紙片貼附完成后置于37 ℃培養(yǎng)箱中24 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 創(chuàng)面愈合評估 觀察大鼠在造模時(shí)及給藥后，創(chuàng)面滲出物、感染情況、上皮覆蓋、肉芽生長等，每天觀察大鼠創(chuàng)面愈合情況，于創(chuàng)傷后0、3、7、14 d，使用電子游標(biāo)卡尺測量創(chuàng)口的長軸與短軸，并計(jì)算其創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)傷愈合率(%)=(第0天創(chuàng)傷面積-第n天創(chuàng)傷面積)/第0天創(chuàng)傷面積×100%。

1.5.2 組織病理學(xué)觀察 傷后第14天取材，將大鼠全皮摘除并修整，用Bouin’s固定液固定24 h，依次脫色、脫水、進(jìn)行石蠟包埋；常規(guī)切片3 μm厚，HE染色后中性樹膠封片。顯微鏡觀察皮膚組織形態(tài)及病理變化。

1.5.3 抑菌圈直徑測量 采用電子游標(biāo)卡尺測量金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌平板上各紙片抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合的大體觀察 創(chuàng)傷3 d后，各組創(chuàng)面均有減小，陽性對照組和高劑量組均有薄膜樣組織生成封閉創(chuàng)面，低劑量組與陰性對照組創(chuàng)面可見炎性滲出物，周圍組織伴有輕度水腫；第7天，各組創(chuàng)面面積較前均有縮小，可見不同程度的上皮爬生，陽性對照組創(chuàng)傷面積最小，高劑量組已產(chǎn)生干痂，低劑量組創(chuàng)傷面積最大，血痂下可見新鮮肉芽組織，陰性對照組創(chuàng)面仍可見少量炎性滲出物，色澤紅潤，未見明顯結(jié)痂。傷后第14天，各組大鼠創(chuàng)面面積縮小顯著，其中陽性對照組、高劑量組及低劑量組縮小最為明顯，幾乎痊愈，損傷皮膚周圍毛發(fā)逐漸生長，陰性對照組創(chuàng)面仍可見，周圍毛發(fā)稀疏。創(chuàng)面愈合大體情況詳見圖1。

2.2 各組創(chuàng)面愈合率 傷后第3天，高劑量組愈合率高于陰性對照組，低于陽性對照組，低劑量組愈合率低于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；傷后第7天 高劑量組愈合率高于陰性對照組(P<0.05)，與陽性對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低劑量組愈合率低于陽性對照組(P<0.05)，與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；傷后第14天，高劑量組愈合率與陽性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但顯著高于陰性對照組(P<0.05)，低劑量組愈合率明顯低于陽性對照組(P<0.05)，但高于陰性對照組(P<0.05)，與治療前比較，各組傷后第3、7、14天愈合率均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

組別傷后第3天傷后第7天傷后第14天陰性對照12.36±1.45c56.80±4.17c93.60±1.05c陽性對照26.40±2.12c65.80±4.21c97.05±0.71c高劑量14.01±1.61abc62.19±3.82ac96.28±0.80ac低劑量12.49±1.33bc54.95±4.07bc95.90±1.01abc

a：與陰性對照組比較，P<0.05；b：與陽性對照組比較，P<0.05；c：與治療前比較，P<0.05。

2.3 組織病理學(xué)表現(xiàn) 大鼠傷后14 d創(chuàng)面修復(fù)情況，各組大鼠創(chuàng)面皮膚已被肉芽組織填滿、表皮完全覆蓋傷口表面。陰性對照組中肉芽組織增生明顯，成纖維細(xì)胞排列整齊，局部可見少量炎性細(xì)胞浸潤；陽性對照組和高劑量組肉芽增生與對照組相比基本相近，成纖維細(xì)胞排列較整齊，局部可見炎性細(xì)胞浸潤；低劑量組中，肉芽組織增生與前三組比相對較少，成纖維細(xì)胞排列稍散亂，局部可見炎性細(xì)胞，見圖2。

2.4 抑菌圈直徑 高劑量與低劑量杉木在金黃色葡萄球菌平板中抑菌圈直徑大于生理鹽水，小于莫匹羅星，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量杉木在大腸埃希菌平板中抑菌圈直徑大于生理鹽水，小于莫匹羅星，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量杉木在大腸埃希菌平板中抑菌圈直徑與生理鹽水無顯著差異(P>0.05)，卻明顯小于莫匹羅星(P<0.05)，見表2。

A：陰性對照組；B：陽性對照組；C：高劑量組；D：低劑量組；藍(lán)色箭頭表示肉芽組織增生；黃色箭頭表示炎性細(xì)胞浸潤；H E染色，×20。圖2 造模后第14天大鼠背部皮膚切片觀察結(jié)果

組別金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生理鹽水6.13±0.096.15±0.06莫匹羅星29.84±3.169.19±1.17高劑量杉木18.43±2.02ab7.14±0.33ab低劑量杉木12.36±1.86ab6.85±0.21b

a：與陰性對照組比較，P<0.05；b：與陽性對照組比較，P<0.05。

3 討論

近年來，在自然界中發(fā)現(xiàn)了許多能輔助創(chuàng)面愈合的抗菌物質(zhì)，這些植物源的抗菌物質(zhì)不但能有效的控制創(chuàng)面感染，改善創(chuàng)面部位的血液循環(huán)，同時(shí)還具有抗炎和一定的鎮(zhèn)痛作用[10-13]。杉木作為我國的特有樹種，是南方地區(qū)的重要造林樹種，其藥用價(jià)值受到了研究學(xué)者們的重視?！度珖胁菟巺R編》中表明杉木性辛微溫，具有祛風(fēng)止痛、散瘀止血，防腐生肌的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，皮膚創(chuàng)面愈合過程是一種局部炎癥反應(yīng)，損傷后48h內(nèi)，巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為組織變性、壞死以及異物清除，增殖期損傷部位成纖維細(xì)胞大量增殖并分泌豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，表皮細(xì)胞遷移、增殖、分化，新生毛細(xì)血管豐富，重塑期形成肉芽組織，且逐漸向瘢痕組織轉(zhuǎn)化重新覆蓋創(chuàng)面[14-15]。杉木芯材主要有效成分為柏木腦、α-杜松醇，相關(guān)研究表明該物質(zhì)可作為一種鎮(zhèn)痛抗炎藥物用于關(guān)節(jié)炎治療[16]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，杉木的組成成分及活性特點(diǎn)已經(jīng)有了較為深入的研究，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明其芯材的精油和提取物均有較強(qiáng)抗菌效果[17]。

本研究通過已有方法[9]提取杉木芯材提取物，結(jié)合新型水性凝膠基質(zhì)——卡波姆，將其制作成外用藥物。由于卡波姆具有較好的生物黏滯性、更長的藥物緩釋時(shí)間及保濕性等特點(diǎn)，藥物載入后可以進(jìn)一步提高療效，因此在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[18-19]。莫匹羅星是臨床常用的治療創(chuàng)傷藥物，可促進(jìn)創(chuàng)傷部位中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞聚集，刺激毛細(xì)血管新生，利于創(chuàng)面愈合，同時(shí)對以金黃色葡萄糖球菌為主的革蘭陽性球菌抑制作用明顯，在臨床上常作為燒傷類及潰瘍類皮膚損傷性疾病的主要治療藥物之一，因此本實(shí)驗(yàn)將其作為分析杉木凝膠創(chuàng)傷愈合效果的陽性對照[20-21]。

結(jié)果表明，傷后3～7d即炎癥反應(yīng)期，陽性對照組和高劑量組愈合效果均顯著；傷后第7～14天即肉芽組織生成期，陽性對照組和高劑量組創(chuàng)面愈合面積均增幅顯著，這是由于在炎癥反應(yīng)后期，創(chuàng)面的炎性反應(yīng)得到了控制，新生的肉芽組織獲得了較好的生長條件；傷后14d即皮膚重塑期，宏觀上，各創(chuàng)面均已基本上皮化，對照組其創(chuàng)面?zhèn)谝矔孕羞M(jìn)行相關(guān)的組織修復(fù)，促進(jìn)傷口愈合。微觀上，組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠的創(chuàng)面均已充填肉芽組織，炎性細(xì)胞局限化，但成纖維細(xì)胞排列存在有不同程度的差異。與對照組相比，陽性對照組和高劑量組均呈現(xiàn)較理想的結(jié)果，而陽性對照組最為顯著。低劑量組內(nèi)細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞增生數(shù)量較對照組明顯較少。因此，利用外用藥物干預(yù)創(chuàng)面愈合的意義在于控制炎性反應(yīng)和肉芽組織的新生，減少創(chuàng)面發(fā)生感染的概率，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

分析抑菌試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杉木原液對金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌具有一定的抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌抑制作用明顯強(qiáng)于大腸埃希菌，濃度越高，抑菌效果越好。皮膚創(chuàng)面損傷優(yōu)勢菌感染以金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌為主，金黃色葡萄球菌可分泌大量神經(jīng)鞘磷脂酶、葡萄糖磷脂酶、絲氨酸蛋白酶等多種酶類物質(zhì)，神經(jīng)鞘磷脂酶、葡萄糖磷脂酶可損傷皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致皮膚重塑過程受阻，創(chuàng)傷破壞皮膚正常屏障功能使局部pH升高，引起絲氨酸蛋白酶活化反應(yīng)，造成角橋粒分解，角質(zhì)層結(jié)構(gòu)難以重建，進(jìn)一步抑制損傷皮膚的愈合[22-23]。大腸埃希菌作為一種機(jī)會致病菌，在皮損愈合過程中亦會抑制組織修復(fù)，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合緩慢。杉木原液通過抑制金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌定植，避免傷口感染，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，對治療皮膚創(chuàng)面具有良好治療價(jià)值[24]。

綜上所述，杉木提取物凝膠劑在外用抗感染及抑菌實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌效果，通過控制炎癥反應(yīng)以降低創(chuàng)面感染的發(fā)生率，從而加速新生肉芽組織的形成以達(dá)到創(chuàng)面修復(fù)組織的作用。