李艷春　葉菁　王義祥

摘要：稻草和牛糞堆制發(fā)酵是生產雙孢蘑菇的重要環(huán)節(jié)，分析發(fā)酵過程中微生物群落動態(tài)變化有助于揭示培養(yǎng)料發(fā)酵的機理以及探討其與溫室氣體排放之間的關系。以稻草和牛糞為原料，采用磷脂脂肪酸（PLFA）生物標記法分析不同碳氮比（C/N=28、33、38、43）條件下發(fā)酵料在不同發(fā)酵階段（第1次高溫期、第2次高溫期、一次發(fā)酵結束、二次發(fā)酵結束）的微生物群落變化。結果表明，發(fā)酵過程中共分離到24種碳鏈長度在12～24的PLFA;隨發(fā)酵進程加深，不同C/N處理的微生物PLFA種類和豐度都有變化，但豐度最高的9個生物標記均為i16 ∶0和a17 ∶0[革蘭氏陽性菌，Gram（+）]，15 ∶0和18 ∶0（細菌），18 ∶2ω6t，9t和18 ∶1ω9c（真菌），16 ∶1ω7c、16 ∶1ω9c和cy19 ∶0[革蘭氏陰性菌，Gram（-）]。不同C/N處理的特征脂肪酸含量在發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)出細菌>Gram（+）>真菌、Gram（-）>放線菌，并且總PLFA、細菌和Gram（+）PLFA含量均呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢，然而Gram（-）和放線菌呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。在第1次和第2次高溫期，隨著C/N增加，總PLFA、細菌和Gram（+）PLFA含量均有增加的趨勢。二次發(fā)酵結束時，C/N=33處理的總PLFA、細菌、Gram（-）、放線菌PLFA含量顯著高于其他處理，C/N=38處理次之。相關性分析表明，放線菌與發(fā)酵溫度、N2O排放速率均呈顯著負相關。

關鍵詞：雙孢蘑菇;培養(yǎng)料;發(fā)酵;微生物群落;磷脂脂肪酸;溫室氣體排放;相關性分析

中圖分類號： S141.4;S181文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0303-06

收稿日期：2018-06-01

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2012BAD14B15、2012BAD14B03-05）;福建省自然科學基金（編號：2015J01102）。

作者簡介：李艷春（1980—），女，山西忻州人，博士，助理研究員，主要從事生態(tài)農業(yè)研究。E-mail：lyc7758@163.com。

通信作者：王義祥，博士，研究員，主要從事碳氮循環(huán)研究。E-mail：sd_wolong@163.com。

稻草和牛糞堆制發(fā)酵是雙孢蘑菇生產的第1個關鍵步驟，其發(fā)酵過程實質上是在稻草和牛糞的原材料混合物內通過多種有益微生物群落的新陳代謝，將原材料最終轉化成為適宜雙孢蘑菇生長的具有高度選擇性的基質。目前一些學者已利用純培養(yǎng)法、PCR-DGGE技術等對蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化和群落演替進行了研究[1-2]，并對培養(yǎng)料中的嗜熱放線菌和真菌進行分離、培養(yǎng)、遺傳多樣性分析[3-4]。培養(yǎng)料發(fā)酵過程中，碳氮比（C/N）高低影響著微生物的數(shù)量和活性，C/N過高或過低都不利于微生物的生長，進而影響碳素的轉化和發(fā)酵質量[5]。此外，一些研究還表明，培養(yǎng)料初始C/N會影響到發(fā)酵過程中CO2、CH4等溫室氣體的排放量[6-7]。可見，C/N與微生物菌群生長、溫室氣體排放之間的關系密切。然而，目前關于C/N對發(fā)酵過程中微生物群落的影響以及微生物菌群與溫室氣體排放之間關系的研究還鮮見報道。

目前，較為常見的幾種土壤微生物多樣性的研究方法均有不足之處。傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)基的微生物技術受培養(yǎng)條件限制而無法研究88%～99%原位微生物[8]。BIOLOG生態(tài)板分析法有固定碳源，操作簡單方便、靈敏度高，能夠產生大量反映微生物代謝特征的數(shù)據(jù)。但該方法只能檢測到可培養(yǎng)、代謝活性強的細菌，代謝活性較慢的細菌和真菌群落不能被檢測到[9]。此外，基于PCR擴增（如DGGE、T-RFLP）的分子技術雖然不受微生物實驗室培養(yǎng)的限制，可以獲取相對全面的種群信息，但該技術不能區(qū)分活體與死體DNA，并且引物序列設計具有人工選擇性[8]。PLFA（phospholipid fatty acid）技術，即磷脂脂肪酸方法，是依據(jù)不同類群的微生物能通過不同的生物化學代謝途徑形成不同種類的磷脂脂肪酸而建立的方法。隨著微生物的死亡，PLFA會迅速降解，因而PLFA技術檢測到的微生物均為活體微生物，并且該方法無需培養(yǎng)微生物，而是通過測定磷脂脂肪酸的種類及含量即可獲得微生物群落信息，是用于監(jiān)測微生物群落動態(tài)變化的一種有效方法[10]。PLFA生物標記法可以較完整地檢測到樣品中微生物群落變化，如真菌、放線菌、革蘭氏陽性菌[Gram（+）]、革蘭陰性菌[Gram（-）]，目前已廣泛應用于環(huán)境樣品微生物群落結構變化的分析[11-13]。為了探討蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵中微生物群落動態(tài)變化及其與溫室氣體排放之間的關系，本研究設置不同C/N培養(yǎng)料處理，采用PLFA技術分析發(fā)酵過程中微生物群落結構變化，并分析微生物群落與溫室氣體排放速率之間的相關關系，以期揭示培養(yǎng)料發(fā)酵的微生物機理及其與溫室氣體排放之間的相關關系。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

牛糞和稻草分別取自福建省南平市三田牧業(yè)有限公司和福建省莆田市的水稻田。發(fā)酵前，牛糞磨成粉粒狀，稻草切成小段（4～6 cm長）。牛糞基本性質為有機碳44.97%、全氮1.94%、C/N 23.18、含水率11.19%;稻草基本性質為有機碳42.87%、全氮0.98%、C/N 43.74、含水率9.44%。

1.2?試驗設計

本試驗以稻草和牛糞（干質量比為8 ∶2）為主料，添加化肥氮源硫酸銨配制不同C/N培養(yǎng)料處理，每個處理重復3次，配方見表1。

1.3?發(fā)酵方法

2015年10月在福建省農業(yè)科學院農業(yè)生態(tài)研究所進行發(fā)酵試驗。用于發(fā)酵的反應箱由PVC板自制而成，總容積1 200 L（100 cm×100 cm×120 cm），主要由裝料箱、進料口、通氣口、排水管、鼓風機、排水管、篩板等部分組成（圖1）。將稻草、牛糞、（NH4）2SO4以及過磷酸鈣水溶液充分混勻，調節(jié)含水率約至70%左右，放入裝料箱，埋入數(shù)顯溫度計以監(jiān)測發(fā)酵料溫度。根據(jù)發(fā)酵料溫度進行翻堆，第7天和第14天進行翻堆，第2次翻堆時（第14天）同時將石膏和石灰均勻拌入發(fā)酵料，整個發(fā)酵過程持續(xù)18 d。0～14 d發(fā)酵過程中頂部加蓋密封，每隔4 h強制吹風15 min（800 L/min的鼓風量），此過程稱為前發(fā)酵。15～18 d發(fā)酵過程中將頂部蓋子打開，并且關閉鼓風機，該過程稱為后發(fā)酵。

1.4?微生物群落分析

分別在發(fā)酵4、9、13、17 d采集培養(yǎng)料樣品用于微生物群落分析，采樣時間所處的發(fā)酵階段依次為第1次高溫期、第2次高溫期、一次發(fā)酵結束、二次發(fā)酵結束。微生物群落結構的分析采用PLFA方法，具體分析步驟按照Wu等方法[14]。脂肪酸的命名參考Frosteg-rd等的文獻[15-16]，采用不同的PLFA標定特定的微生物[10]：12 ∶0、13 ∶0、15 ∶0、18 ∶0和20 ∶0 標記細菌，i14 ∶0、a15 ∶0、i16 ∶0和a17 ∶0標記Gram（+），16 ∶1ω14t、16 ∶1ω7c、16 ∶1ω9c、18 ∶1ω7t、cy17 ∶0和cy19 ∶0標記Gram（-），10Me18 ∶0和10Me19 ∶0標記放線菌，18 ∶2ω6t，9t和18 ∶1ω9c標記真菌，20 ∶4ω6c（6，9，12，15）標記原生動物。

1.5?氣體采集與測定

分別在發(fā)酵4、9、13、17 d采集氣體（氣體采集之后進行培養(yǎng)料取樣用于微生物分析）。溫室氣體采集方法和步驟如下[6]：關閉鼓風機→打開反應箱頂蓋（持續(xù)交換箱內外氣體30 min）→采集周邊空氣樣品→反應箱頂蓋蓋好密封→30 min 后從頂蓋預留的取氣口采集箱內氣體樣品。采集的氣體樣品存放在0.25 L密閉氣袋內，利用氣相色譜儀（安捷倫7890B）進行測量。由2次采集氣體的濃度差，通過公式（1）計算溫室氣體（CO2、CH4、N2O）的排放速率[16，19-20]。

F=ρ·V·（dC/dt）·273/（273+T）/m。（1）

式中：F為被測氣體（CO2、CH4、N2O）的排放速率，mg/（kg·h）;ρ為被測氣體標準狀態(tài)下的密度（CO2、CH4、N2O的密度分別為1.977、0.717、1.978 kg/m3）;V為取樣箱頂部空間的體積，m3;dC/dt表示采樣箱內被測氣體的濃度變化率;T表示采樣過程中采樣箱內的平均溫度，℃;m表示培養(yǎng)料的質量，kg。

1.6?數(shù)據(jù)處理

方差分析和斯皮爾曼等級相關（Spearman Rank correlation）分析采用軟件MATLAB 7.0。

2?結果與分析

2.1?培養(yǎng)料微生物PLFA信息分析

發(fā)酵過程中，共分離到24種碳鏈長度在12～24的PLFAs。隨發(fā)酵進程加深，不同C/N處理的微生物PLFAs種類和豐度都有變化。但不同處理培養(yǎng)料中磷脂脂肪酸豐度最高的9個生物標記均為i14 ∶0、a15 ∶0、i16 ∶0和a17 ∶0[Gram（+）]，15 ∶0和18 ∶0（細菌），18 ∶2ω6t，9和18 ∶1ω9c（真菌），cy19 ∶0[Gram（-）]（圖2）。

2.2?總PLFA含量變化

培養(yǎng)料發(fā)酵4、9、13、17 d所處的發(fā)酵階段依次為第1次高溫期（54.4～67.1 ℃）、第2次高溫期（49.2～63.7 ℃）、一次發(fā)酵結束（34.3～46.6 ℃）、二次發(fā)酵結束（42～47.4 ℃）（圖3）。整個發(fā)酵過程中總PLFA含量高達1 181.25～2 365.37 nmol/g，呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。在第1次高溫期，總PLFA含量較高（1 619.14～2 350.63 nmol/g），并且隨著碳氮比增大而增加;在第2次高溫期總PLFA含量有所降低（1 181.25～1 733.29 nmol/g），C/N=43處理顯著高于其他處理;一次發(fā)酵結束時總PLFA含量有所增加，但增幅較小;二次發(fā)酵結束時總PLFA含量明顯增加，C/N=28、33、38處理的總PLFA含量較第1次高溫期增加了26.14%、46.09%和11.35%，而C/N=43處理的總PLFAs含量較第1次高溫期減少了11.18%。

2.3?細菌PLFA含量變化

整個發(fā)酵過程中細菌PLFA含量高達907.81～1 902.65 nmol/g，占到總PLFA含量的74%以上。隨發(fā)酵進程的加深，其變化趨勢與總PLFA含量的變化趨勢一致，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢（圖4）。在第1次高溫和第2次高溫期，細菌PLFA含量有隨C/N比增大而增加的趨勢;一次發(fā)酵結束和二次發(fā)酵結束時C/N=33處理的細菌PLFA含量最高。二次發(fā)酵結束時C/N=28、33、38處理細菌PLFAs含量較第1次高溫期增加了31.75%、50.62%和7.76%，而C/N=43處理總PLFAs含量較第一次高溫期減少了16.41%。

2.4?Gram（+）和Gram（-）PLFA含量變化

在整個發(fā)酵過程中，Gram（+）PLFA含量都比較高，占總PLFA含量的50%以上，呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢（圖5-a）。在第1次高溫期和第2次高溫期時，隨C/N比的增加Gram（+）含量有增加趨勢，其他發(fā)酵階段各處理間的差異不明顯。Gram（-）PLFA含量占細菌PLFA含量的8%～28%，呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢（圖5-b）。二次發(fā)酵結束時，C/N=28、33、38、43處理的Gram（-）PLFA含量分別比發(fā)酵初期增加了1.79、2.43、2.58、0.86倍。Gram（-）/Gram（+）比值呈逐漸增加的趨勢（圖5-c）。有研究表明，Gram（-）/Gram（+）可作為營養(yǎng)壓力指標[17]，比值越大說明可利用的營養(yǎng)物質越多。

2.5?真菌PLFA含量變化

整個發(fā)酵過程中真菌PLFA含量較低，占總PLFA含量的10%～21%。發(fā)酵4、9、17 d，C/N=28、33、38處理間的真菌含量差異不顯著，但都顯著低于C/N=43處理（圖6）。

2.6?放線菌PLFA含量變化

整個發(fā)酵過程中放線菌PLFA含量較低，占總PLFA含量的1%～7%，呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢（圖7）。二次發(fā)酵結束時， C/N=28、33、38、43處理的放線菌PLFA含量分別比發(fā)酵初期增加了1.07、2.34、1.09、1.65倍。

2.7?溫室氣體排放速率

在培養(yǎng)料發(fā)酵過程中，各處理的CO2排放速率都比較高，變幅在157.48～772.21 mg/（kg·h）（表1）。隨發(fā)酵時間的延長，CO2排放速率呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，這與發(fā)酵過程中進行的翻堆管理有關。在發(fā)酵9 d時，各處理間CO2排放速率差異顯著（P<0.05），并且呈現(xiàn)出隨著C/N比增加而減少的趨勢。培養(yǎng)料發(fā)酵過程中可能會出現(xiàn)局部厭氧環(huán)境，此時微生物發(fā)生厭氧消化產生CH4。然而，本發(fā)酵過程中各處理的CH4排放速率都相對較低，保持在0.03～0.06 mg/（kg·h），沒有明顯的變化規(guī)律，說明本試驗條件下通風狀況良好，不易產生厭氧狀況。各處理的N2O排放速率也相對較低，保持在0.01～0.06 mg/（kg·h），發(fā)酵9、13、17 d 時呈現(xiàn)出隨C/N比增加而減少的趨勢。

2.8?微生物菌群與溫室氣體排放、環(huán)境因子的相關性

通過對培養(yǎng)料中各類微生物菌群與溫室氣體排放速率、發(fā)酵溫度、C/N比值的相關性分析發(fā)現(xiàn)，總PLFA和細菌、Gram（+）、真菌（PLFA含量）都與C/N比有較大的正相關性，但都未達到顯著水平;放線菌PLFA含量與溫度、N2O排放速率均呈顯著負相關。Gram（-）PLFA含量與溫度、CH4排放速率有較大的負相關性（表2）。

3?討論與結論

雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵是一個復雜的生物化學過程，整個過程是通過微生物群落不斷演替來完成的。已有研究表明，在發(fā)酵初始，中溫微生物利用培養(yǎng)料中簡單有機質釋放熱量和CO2，使培養(yǎng)料升溫，之后嗜熱微生物成為優(yōu)勢群落;當培養(yǎng)料溫度上升至60 ℃以上時，細菌大量繁殖，大量簡單糖類被分解;發(fā)酵后期，隨著營養(yǎng)物質的分解以及料溫降低，放線菌及霉菌開始大量繁殖[18-19]。本研究表明，在整個發(fā)酵過程中不同處理的特征脂肪酸含量大小均為細菌>Gram（+）>真菌、Gram（-）>放線菌，并且微生物總PLFA和細菌、Gram（+）PLFA含量均呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢，而Gram（-）和放線菌PLFA含量呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。因此，在此發(fā)酵過程中微生物可能的演替過程是：第1次高溫期時，嗜熱細菌吸收培養(yǎng)料基質中的可溶性糖類、蛋白質、氨基酸等快速增殖，總PLFA、細菌PLFA、Gram（+）PLFA含量較高;第2次高溫期由于易降解物質耗盡，而培養(yǎng)料中不溶性木質素、纖維素等物質還未完全降解，因此總PLFA、細菌PLFA、Gram（+）PLFA含量大幅下降;但隨著發(fā)酵的進行，放線菌逐漸增加，使得培養(yǎng)料中不溶性木質素、纖維素等物質逐漸降解[20]，微生物可利用營養(yǎng)增加，在二次發(fā)酵結束時各類微生物量均顯著增加。此外，利用宏基因組方法分析以稻草和玉米秸稈為主要原料堆肥生境微生物區(qū)系變化的研究中，也發(fā)現(xiàn)大部分放線菌都出現(xiàn)在堆肥的一次和二次發(fā)酵結束階段[21]，與本研究結果一致。但發(fā)酵過程中真菌含量較低且沒有明顯的變化趨勢，其原因可能是高溫發(fā)酵過程中，溫度變化范圍不利于真菌生長，使得大部分真菌群落處于休眠狀態(tài)或死亡。

培養(yǎng)料堆制發(fā)酵是一個復雜的反應體系，培養(yǎng)料初始C/N 的大小強烈影響微生物群落組成和數(shù)量。在發(fā)酵的第1次高溫期和第2次高溫期，總PLFA和細菌、Gram（+）PLFA含量均呈現(xiàn)出隨著C/N增加而增加的趨勢。二次發(fā)酵結束時，C/N=33處理的總PLFA、細菌、Gram（-）、放線菌PLFA含量明顯高于其他處理，C/N=38處理次之。據(jù)報道，放線菌和一些霉菌在二次發(fā)酵期間能夠轉化易分解的有機物，同化或揮發(fā)游離氨，消耗簡單的糖類，留下大量的菌體蛋白質和腐殖質復合體，因此放線菌可作為評價堆體發(fā)酵質量的一個指標[22]。之前通過評價子實體產量和生物學效率發(fā)現(xiàn)C/N=33 和C/N=38處理效果最佳[6]，與此結果一致。該研究從微生物學角度進一步明確了雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵前最佳C/N為33 ∶1。

相關性分析表明：放線菌PLFA含量與發(fā)酵溫度、N2O排放速率均呈顯著負相關?？梢?，發(fā)酵溫度、N2O排放速率是影響放線菌數(shù)量的重要因素。N2O產生于堆肥過程中銨態(tài)氮的硝化和硝態(tài)氮的反硝化過程[23]，因此關于微生物與N2O排放之間的關系，需進一步從硝化細菌、反硝化細菌等功能菌方面進行研究。

本研究結果表明，發(fā)酵過程中共分離到24種碳鏈長度在12～24的PLFAs;隨發(fā)酵進程加深，不同C/N處理的微生物PLFAs種類和豐度都有變化，但豐度最高的9個生物標記均為i14 ∶0、a15 ∶0、i16 ∶0和a17 ∶0[Gram（+）]，15 ∶0和18 ∶0（細菌），18 ∶2ω6t，9t和18 ∶1ω9c（真菌），cy19 ∶0[Gram（-）]。

不同C/N處理的特征脂肪酸含量在發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)出細菌>Gram（+）>真菌、革蘭氏陰性菌Gram（-）>放線菌，并且總PLFAs和細菌、Gram（+）PLFAs均呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢，而革蘭氏陰性菌和放線菌呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。

在發(fā)酵的第1次高溫期和第2次高溫期，總PLFA、細菌和Gram（+）PLFA含量均呈現(xiàn)出隨著C/N增加而增加的趨勢。二次發(fā)酵結束時，C/N=33處理的總PLFA、細菌、Gram（-）、放線菌PLFA含量顯著高于其他處理，C/N=38處理次之。

相關性分析表明，總PLFAs和細菌、G（+）、真菌PLFA含量都與C/N比有較大的正相關性，但均未達到顯著水平;放線菌PLFA含量與發(fā)酵溫度、N2O排放速率均呈顯著負相關。

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