胡波 王芳 范志宇 宋艷華 魏后軍 薛家賓 姜平

摘要：為確定Sf9昆蟲細胞系作為疫苗生產細胞株的安全性，檢測了Sf9細胞對裸鼠的致瘤性。將3周齡SPF級雌性裸鼠隨機分為5組，分別為Sf9基礎細胞庫細胞組、Sf9最高限制代次細胞組、陽性對照Hep-2細胞組、陰性對照CEF細胞組和空白對照組，以各自細胞懸液皮下接種裸鼠。在接種后21 d和84 d觀察接種部位腫瘤形成情況，并進行病理組織學檢查。結果顯示，接種后21 d，Hep-2細胞組裸鼠注射部位形成米粒大小結節(jié)，經病理組織學檢查為鱗狀細胞癌，而CEF細胞組和Sf9細胞組注射部位均無結節(jié)。接種后84 d，經病理組織學檢查，CEF細胞組和Sf9細胞組均無腫瘤形成。本研究表明基礎代次和最高限制代次Sf9細胞均不具有致瘤性，Sf9細胞可用于疫苗生產。

關鍵詞：Sf9細胞;致瘤性;裸鼠;疫苗;安全性

中圖分類號： S852.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0209-03

收稿日期：2018-06-15

基金項目：現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（編號：CARS-43-C-1）。

作者簡介：胡?波（1982—），男，江蘇南京人，博士，副研究員，主要從事畜禽疫病防控與獸醫(yī)生物技術研究。Tel：（025）84390337;E-mail：hubolshg@163.com。

通信作者：姜?平，博士，教授，主要從事動物傳染病學研究。Tel：（025）84396640;E-mail：jiangp@njau.edu.cn。

昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS）屬于真核細胞表達系統(tǒng)，廣泛用于制備重組蛋白和病毒樣顆粒以進行基礎生命科學和生物醫(yī)藥領域研究，據(jù)報道已成功用于數(shù)百種外源蛋白的表達[1]。目前，該系統(tǒng)研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcNPV），其宿主是草地貪夜蛾卵巢細胞（Sf9細胞）。

利用BEVS系統(tǒng)可實現(xiàn)在Sf9細胞中高水平表達外源蛋白，所表達的外源蛋白幾乎均為可溶性蛋白，其生物學活性接近天然來源的分離物，因此可利用BEVS生產各種動物疾病的免疫疫苗或治療藥物。目前，國內動物疫苗研究中，已有豬流行性腹瀉病毒[2]、偽狂犬病病毒[3]、豬圓環(huán)病毒[4-5]、禽流感病毒[6]、新城疫病毒[7-8]、兔出血癥病毒[9]等數(shù)十種動物病毒的抗原蛋白在Sf9細胞中表達。據(jù)我國獸用生物制品相關規(guī)定，作為動物疫苗生產的Sf9細胞株，需對該細胞進行致瘤性檢驗以確保疫苗的安全性[10]。本研究取不同代次的Sf9昆蟲細胞，采用裸鼠體內接種法檢測其致瘤性，為Sf9昆蟲細胞作為疫苗生產細胞株的安全性提供試驗依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?細胞與培養(yǎng)基

Sf9昆蟲細胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），由筆者所在實驗室傳代并保存;Hep-2細胞購自中國科學院細胞庫;CEF原代細胞由筆者所在實驗室分離培養(yǎng);Sf-900TMⅡSFM培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司。

1.2?實驗動物

3周齡SPF雌性裸鼠購自南京大學模式動物研究所，飼養(yǎng)于實驗動物中心屏障系統(tǒng)隔離器中嚴格無菌飼養(yǎng)。

1.3?細胞傳代及細胞庫的建立

將筆者所在實驗室保存的Sf9細胞作為原始種子1代，按細胞傳代方法以“1傳3，2 d傳1代”方式，于27～28 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代培養(yǎng)至60代，建立Sf9細胞原始細胞庫（第5代）、基礎細胞庫（第10代）、工作細胞庫（第15代），并規(guī)定最高限制代次細胞為60代。

1.4?細胞接種

將3周齡SPF級雌性裸鼠50只隨機分為5組，分別設為Sf9基礎細胞庫細胞組、Sf9最高限制代次細胞組、陽性對照Hep-2細胞組、陰性對照CEF細胞組和不作任何處理的空白對照組，每組10只。基礎細胞庫細胞組裸鼠每只皮下注射1×107個/0.2 mL第10代Sf9細胞懸液，最高限制代次細胞組裸鼠每只皮下注射1×107個/0.2 mL第60代Sf9細胞懸液，陽性對照組裸鼠每只皮下注射1×106個/0.2 mL Hep-2細胞懸液，陰性對照組裸鼠每只皮下注射1×106個/0.2 mL CEF細胞懸液。

1.5?腫瘤觀察及判定

各細胞試驗組連續(xù)觀察14 d，檢查接種部位皮下是否有腫瘤形成。如有結節(jié)或可疑病灶，繼續(xù)觀察7 d，取病變部位組織，采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，普通光學顯微鏡下進行病理組織學檢查。未發(fā)現(xiàn)結節(jié)裸鼠，分別于注射后21 d和84 d，各取一半裸鼠脫頸椎處死，對接種部位進行解剖檢查，觀察各淋巴結和各器官中有無結節(jié)形成，如果可疑進行病理組織學檢查。

2?結果與分析

2.1?Sf9細胞顯微鏡觀察

對第5、10、15、60代Sf9細胞進行顯微鏡觀察拍照，由圖1可知，各代次細胞的形態(tài)較為一致，呈圓形、晶瑩透亮、大小均一，直徑約為15 μm。

2.2?裸鼠外部及解剖觀察

各代次細胞接種裸鼠后，在試驗觀察期內各組動物均健康存活。在接種后14 d，陽性對照Hep-2細胞組裸鼠經外部觀察，發(fā)現(xiàn)注射部位有粟米大小的結節(jié)（腫塊）形成，至21 d 結節(jié)變大（圖2-A），經解剖發(fā)現(xiàn)注射部位有米粒大結節(jié)（圖2-F），各淋巴結、器官均正常，未見結節(jié)形成;而陰性對照（CEF細胞組、Sf9基礎細胞庫細胞組和Sf9最高限制代次細胞組）注射部位未見有結節(jié)形成;在接種后84 d，與空白對照組（圖2-E、圖2-J）和陰性對照CEF細胞組（圖2-B、圖2-G）相比，Sf9基礎細胞庫細胞組（圖2-C、圖2-H）和Sf9最高限制代次細胞組裸鼠（圖2-D、圖2-I）經外部觀察，注射部位未見有結節(jié)形成，解剖后，注射部位未見有結節(jié)，各淋巴結、各內臟器官正常，未見有結節(jié)形成。

2.3?病理組織學檢查

陽性對照Hep-2細胞組裸鼠，在接種細胞21 d后進行解剖，發(fā)現(xiàn)注射部位有米粒大結節(jié)。取注射部位病變組織，采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，普通光學顯微鏡下做病理組織學檢查。結果顯示，病變部位組織內為鱗狀細胞癌（圖3-A），陽性對照組接種腫瘤形成率為100%;在接種后84 d，與空白對照組和陰性對照CEF細胞組相比，Sf9基礎細胞庫細胞組和Sf9最高限制代次細胞組經解剖后，注射部位未見有結節(jié)，各淋巴結、各內臟器官均正常，未見有結節(jié)形成，隨機選取Sf9基礎細胞庫細胞組和Sf9最高限制代次細胞組裸鼠肝臟、脾臟做病理組織學檢查，未發(fā)現(xiàn)有瘤細胞（圖3-B、圖3-C和圖3-D、圖3-E）。

3?討論與結論

鑒于昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS）可獲得大量免疫原性好、與天然蛋白功能相似的可溶性重組蛋白，已被用于蛋白質表達、疫苗生產和病毒制備等各方面[11]。重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞后可對外源蛋白進行許多真核細胞的轉錄后加工作用，包括蛋白質折疊及糖基化、磷酸化、酰基化等。同時，相比于哺乳動物細胞，Sf9細胞為半貼壁細胞，可在不需要對細胞進行馴化和改造的情況下直接在培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，這為大規(guī)模高密度培養(yǎng)昆蟲細胞創(chuàng)造了必要條件，因而其作為外源蛋白的表達細胞具有較明顯優(yōu)勢。

BEVS作為疫苗生產用表達系統(tǒng)已進行了廣泛研究并取得了大量成果。人用疫苗研究方面，GSK公司應用BEVS系統(tǒng)研制的HPV16/18雙價疫苗，已于2007年獲得批準上市[12-13]，另有多項采用該表達系統(tǒng)的人類亞單位疫苗進入Ⅱ期和Ⅲ期臨床研究階段，如流感疫苗[14-15]、戊肝疫苗[16]、糖尿病疫苗[17]等。動物疫苗研究方面，Sf9昆蟲細胞已用于豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）基因工程亞單位疫苗的商品化制備[18]，取得了良好的經濟效益。Sf9細胞作為BEVS系統(tǒng)常用的細胞株，必將在亞單位疫苗研發(fā)及產品制備中發(fā)揮重要作用，其安全性評價具有重要意義。

本研究根據(jù)獸用生物制品生產用細胞系試驗研究指導原則和中國獸藥典的要求，將不同代次Sf9細胞接種于裸鼠皮下，結果顯示細胞接種后直至84 d均無結節(jié)形成，病理組織學檢測無異常，表明Sf9細胞對裸鼠不具有致瘤性，安全性良好，可用于疫苗生產。

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