王立霞 孟慶玲 喬軍 郭晶 伍曄暉 才學鵬 蔡擴軍 王登峰

摘要：應用PCR技術對單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）新型內化素lmo0549基因進行克隆和測序，并對其進行生物信息學分析;通過擴增獲得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中區(qū)序列，并將其亞克隆至pET-32a（+）表達載體，轉入大腸桿菌中用異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，簡稱IPTG）誘導表達，應用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE）和蛋白質印跡法（western blot）鑒定重組蛋白的表達形式及其抗原特異性。序列分析結果表明，擴增得到的lmo0549基因全長為2 034 bp，編碼677個氨基酸，其信號肽序列是前23個氨基酸，在Lmo0549蛋白氨基酸序列中，從N端到C端分別包括5個富含亮氨酸的重復基序（LRR）、1段PKD重復序列和1個WxL結構域;同時還存在N-聯(lián)糖基化位點10個、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點14個、蛋白激酶C磷酸化位點15個。同源性分析顯示，LM-SB5 lmo0549基因編碼的蛋白氨基酸序列與標準株李斯特菌EGD-e，（NC_003210.1）蛋白氨基酸序列的同源性為88.04%，且在單核細胞增生李斯特菌中具有較高的保守性。SDS-PAGE分析顯示，表達的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中區(qū)具有與理論值33.8 ku相符的分子質量;蛋白質印跡法分析表明，重組蛋白Lmo0549 與LM陽性血清可發(fā)生特異性免疫反應，為進一步探討Lmo0549在LM侵入宿主細胞的分子作用機制奠定了前期基礎。

關鍵詞：單核細胞增生李斯特菌;內化素Lmo0549;克隆;分子特征;原核表達

中圖分類號：S852.61?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0199-05

收稿日期：2018-05-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360596、30960274）;國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD0500900）;烏魯木齊市科技局渝烏科技合作項目（編號：Y161220001）;新疆生產建設兵團中青年科技創(chuàng)新領軍人才計劃（編號：2016BC001）。

作者簡介：王立霞（1992—），女，甘肅隴西人，碩士，研究方向為病原分子生物學。E-mail：645432907@qq.com。

通信作者：喬?軍，博士，教授，研究方向為畜禽病原分子生物學。E-mail：qj710625@163.com。

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡稱LM）是一種兼性厭氧的胞內寄生革蘭氏陽性人畜共患病原菌[1]。該菌在自然界中廣泛存在，可在高鹽和酸性環(huán)境下存活[2]，易污染肉類、蛋類、奶制品等動物源性食物，對食品衛(wèi)生安全造成嚴重的威脅[3]。同時，LM可以突破宿主血腦屏障和血胎屏障，臨床上引起動物腦膜腦炎和流產等癥狀[4-5]，對畜牧業(yè)造成較大危害。因此，世界衛(wèi)生組織（WHO）把LM列為四大食源性致病菌之一[6-7]。

LM作為一種細胞內寄生的致病菌，可以感染專職和非專職吞噬細胞，并在胞內長期生存。在LM侵染宿主細胞時，許多毒力蛋白發(fā)揮了重要的作用[8]?，F有研究證實，內化素家族（internalins）是與LM侵染和致病力密切相關的一類蛋白，位于LM表面[9]，在LM侵入宿主細胞時發(fā)揮著重要的作用[10]。目前，在LM基因組中已經發(fā)現的內化素約有20余種，其中在介導LM穿越宿主血腦屏障、血胎屏障的過程中起重要作用的內化素有InlA和InlB[11-14]。Faralla等發(fā)現，新型毒力因子InlP可介導對胎盤的親嗜性[15];Popowska等研究發(fā)現，InlL是一種新型的黏附素，既可參與生物膜的形成，也可與構成黏液層的主要分泌黏蛋白結合，發(fā)揮黏附作用[16]。然而，目前許多內化素的生物學功能仍不清楚，因此深入開展LM毒力因子-內化素生物學功能研究，對于揭示LM感染的分子機制具有重要的科學價值。

Lmo0549是近年來發(fā)現的一個含有WxL結構域的新型內化素，而WxL蛋白屬于表面蛋白Csc家族。在LM表面蛋白Csc家族中，只有Lmo0549含有N端LRR區(qū)，至今其生物學功能和作用機制尚不清楚。本試驗對lmo0549基因進行克隆、序列分析和氨基端抗原表位較強的區(qū)域進行表達研究，為進一步探討LM在侵入宿主細胞中的分子作用機制奠定前期基礎。

1?材料與方法

1.1?主要菌株與試劑

單核細胞增生李斯特菌野毒株LM-SB5、大腸桿菌（Escherichia. coli） DH5α、大腸桿菌 BL21（DE3）均由筆者所在的實驗室保存;pMD19-T載體、T4連接酶、DNA Marker、蛋白Marker均購自TaKaRa公司。

1.2?引物設計與合成

根據GenBank登錄的lmo0549基因序列（登錄號為984412），運用Primer 5.0設計1對特異性引物：lmo0549-F，5′-ATGAAATTTAATTGGAAAGTAGTTCTGCTG-3′;lmo0549-R，5′-TTATGGTCGAGGCGCATCCTC-3′。同時，設計擴增lmo0549氨基端抗原集中區(qū)（1～159位氨基酸）的上、下游特異性引物：lmo0549C-F，5′-CGGAATTCATGAAATTTAATTGGAAAGTAGT-3′;lmo0549C-R，5′-CCTCGAGTCCATTTGGTGCCTTTAA-3′。在lmo0549C-F和lmo0549C-R引物的5′端分別加酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ（下劃線）及保護性堿基（斜體），將設計好的引物發(fā)至北京華大基因生物公司合成。

1.3?lmo0549基因的擴增、克隆及其編碼蛋白分子特征分析

以LM-SB5菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增lmo0549基因，反應體系如下：水9.0 μL，PCR Mixture8.0 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2.0 μL。PCR反應條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 50 s，51 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，33個循環(huán);72 ℃ 10 min。將回收純化的目的片段克隆至pMD19-T載體后送至華大基因生物技術公司測序，并將測序正確的質粒命為pMD19-T-lmo0549。利用在線軟件protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析內化素lmo0549基因的氨基酸組成及其編碼蛋白的理論分子質量;應用motif（http：//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）在線軟件分析該基因的糖基化位點;應用predictprotein（http：//www.predictprotein.org/）和expasy（http：//www.swissmodel.expasy.org/）分析其二級結構和三級結構;采用smart（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/）預測其蛋白結構域;利用DNAstar軟件分析其抗原表位;在NCBI中檢索富含亮氨酸重復基序、WxL結構域和表面蛋白的糞腸球菌、植物乳桿菌和不同李斯特菌株的氨基酸序列，應用MEGA 5.0構建系統(tǒng)進化樹（NJ法，1 000次重復）。

1.4?lmo0549基因編碼蛋白氨基端抗原集中區(qū)的擴增

應用盧海亭等的方法[17]構建重組質粒pMD19-T-lmo0549C。

1.5?重組蛋白Lmo0549C的誘導表達與鑒定

用EcoRⅠ/XhoⅠ對pMD19-T-lmo0549C和pET-32a（+）進行同步雙酶切，分別回收目的片段和載體，采用T4連接酶連接，構建原核表達載體pET-32a（+）-lmo0549C，運用PCR及雙酶切鑒定，鑒定正確的重組表達載體并命名為pET-32a（+）-lmo0549C。將pET-32a（+）-lmo0549C重組表達質粒轉化至大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細胞。用15% SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達情況，同時運用蛋白質印跡法分析其反應原性。

2?結果與分析

2.1?lmo0549基因的擴增與克隆

經瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增獲得的目的條帶與預期值2 034 bp相符（圖1）。對陽性克隆pMD19-T-lmo0549進行PCR篩選和鑒定，并進行測序分析，表明目的基因已成功克隆至T載體。

2.2?lmo0549基因測序結果及分子特征分析

Lmo0549蛋白基因全長2 034 bp，編碼677個氨基酸。SMART軟件分析結果（圖2）表明，Lmo0549蛋白氨基酸序列中從N端到C端包含5個富含亮氨酸的重復基序（LRR，134～181、182～211、212～232、233～277、278～292位氨基酸），1段PKD重復序列（360～452）和1個WxL結構域（541～675）。SingalP分析結果顯示，該蛋白氨基酸序列第1個至第23個氨基酸殘基構成信號肽;TMHMM分析表明，Lmo0549蛋白第7～26位氨基酸為跨膜區(qū)，第134～675位共541個氨基酸為成熟肽蛋白，其中亮氨酸占9.3%。Motif Scan分析結果（圖3）表明，成熟蛋白上含有潛在的N-聯(lián)糖基化位點10個、依賴于cAMP-cGMP蛋白激酶磷酸化位點2個、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點14個、蛋白激酶C磷酸化位點15個。二級結構和3D結構分析結果（圖4）顯示，Lmo0549蛋白主要由無規(guī)卷曲和延伸鏈連接α-螺旋和β-轉角形成中空狀的靴狀結構，其中靴筒部分是與宿主細胞作用的入侵相關結構域集中區(qū)。DNAstar分析表明，Lmo0549蛋白B細胞抗原表位主要集中在24～123、144～185、193～271、296～363、403～423、465～492、535～583、593～613、621～676位氨基酸序列。

2.3?Lmo0549蛋白氨基酸序列同源性及遺傳進化分析

lmo0549基因編碼的蛋白氨基酸序列與GenBank中LM EGD-e的假定蛋白（登錄號為NP_464077.1）同源性為8804%。BLAST分析顯示，Lmo0549蛋白在LM中具有較高的保守性，在LM中氨基酸同源率為88%～100%。遺傳進化分析結果（圖5）表明，Lmo0549蛋白與LM富含亮氨酸重復結構域蛋白（登錄號為WP_003727281.1）位于同一遺傳分支，同源性達到99.56%，親緣關系最近，表明該蛋白富含亮氨酸的重復基序。Lmo0549蛋白與LM Lmo0549家族含有WxL結構域的2類內化素（登錄號為WP_047932789.1）的同源性為87.74%，表明該蛋白屬于Lmo0549家族含有WxL結構域的2類內化素。Lmo0549蛋白與糞腸球菌和植物乳桿菌的親緣關系相對較遠。

2.4?lmo0549基因氨基端抗原集中區(qū)的擴增結果

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到與預期值477 bp 相符的單一條帶。對pMD19-T-lmo0549C重組質粒雙酶切，由1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得與目標值相符的2 692、477 bp 2條帶，表明已成功克隆獲得了lmo0549C（圖6）。

2.5?pET-32a（+）-lmo0549C重組表達載體鑒定及誘導表達

重組質粒經雙酶切鑒定，可得到大小約477 bp的目的片段和5 900 bp的pET-32a（+）載體片段，與預期一致（圖7），表明重組載體pET-32a（+）-lmo0549C已構建成功。pET-32a（+）-lmo0549C轉化至大腸桿菌BL21（DE3）細胞，經IPTG誘導表達后，SDS-PAGE分析表明融合蛋白Lmo0549C大小為33.8 ku，且表達量較高。將菌體超聲破碎離心后分析顯示，重組蛋白Lmo0549C主要以包涵體的形式存在;蛋白質印跡法分析結果表明，表達重組蛋白與兔抗單增李斯特菌陽性血清發(fā)生反應可出現單一的反應條帶（圖8），表明重組蛋白Lmo0549C已成功表達，且具有一定的反應原性。

3?討論與結論

LM是一種兼性胞內寄生的革蘭氏陽性病原菌，在入侵宿主細胞的過程中，包括毒力因子、黏附分子、內化素等眾多蛋白分子，構成了一系列復雜的過程[18]。內化素家族（internalins）是由LM毒力相關基因編碼的一組蛋白，位于LM菌體的表面[9，19-20]， 現有研究證實，LM的內化素家族共有25～27個成員，其中以富含亮氨酸的重復結構串聯(lián)排列在氨基末端區(qū)域為特征的InlA、InlB、InlC、InlC2、InlD、InlH和InlJ，具有相似的結構，在入侵宿主細胞過程中發(fā)揮著重要作用。

根據內化素的分子結構特征，LM內化素可分為3類[18]：第1類可直接與蛋白共價結合到細胞壁肽聚糖上，具有LPXTG結構，共有21個成員;第2類能夠促進細胞壁磷脂酸的解旋，具有以二肽（GW）為重復轉錄起始位點的內化素，共有2個成員;第3類為缺少結合位點的分泌蛋白，InlC是其中的一員[21]。近年來，一些新的LM內化素被發(fā)現。Stachowiak等發(fā)現，內化素蛋白Lmo0171具有雙重功能，既可介導黏附和內化作用，也可影響細胞骨架的重排[22]。姚浩等發(fā)現，內化素LM NTSN 0282與其入侵腸上皮細胞相關[23]。王少輝等證實，InlK在LM的侵襲、體內定殖和存活能力方面發(fā)揮著重要的作用[4]。

遺傳進化樹分析顯示，Lmo0549蛋白在LM中有較高的序列保守性，屬于含有WxL結構域的第2類內化素，在其羧基端具有指導非共價結合至細胞表面的WxL結構域。研究表明，含有WxL結構域的WxL蛋白在細菌表面形成多組分復合物[24]。WxL蛋白屬于近年來發(fā)現的表面蛋白Csc家族，LM基因組包含2個Csc樣基因簇：lmo0549、lmo0550、lmo0551和lmo0552基因形成第1簇，而lmo0585、lmo0586和lmo0587構成第2簇，其中4種基因產物具有C端WxL結構域，但只有Lmo0549含有N端LRR區(qū)。Brinster等已經證明，糞腸球菌WxL蛋白EF2686可通過WxL結構域與肽聚糖結合而存在于細菌的表面[25]，推測Lmo0549通過類似的機制附著于細菌表面。

本研究對lmo0549編碼的氨基酸序列分析表明，在其N端存在5個LRR基序，但在其后面還存在1段PKD重復序列，其中PKD重復序列與細胞黏附有關[11]，因此推測Lmo0549可能參與細菌對宿主細胞的侵染過程。本研究通過對lmo0549進行克隆、表達和分子特征分析，為深入研究其功能以及它們與毒力因子、侵入宿主細胞之間的相互關系，進而揭示Lmo0549在LM侵入宿主細胞的分子機制打下了前期基礎。

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