王寧寧 王偉杰 王玉康 曹維 李明 Sundus Zafar 胡茂龍 浦惠明 譚小力
摘要:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法(floral-dip)是一種簡(jiǎn)便、快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化法,在擬南芥中已得到了廣泛的應(yīng)用,但由于諸多因素的影響,其在油菜中的轉(zhuǎn)化效率受到了很大的制約。以甘藍(lán)型油菜為研究對(duì)象,通過對(duì)雌蕊柱頭開裂時(shí)間的研究,發(fā)現(xiàn)即將開放的10~15個(gè)花苞的柱頭是裂開的,此時(shí)最有利于農(nóng)桿菌進(jìn)入子房室完成轉(zhuǎn)化。對(duì)這部分花蕾進(jìn)行浸花法轉(zhuǎn)化,得到的T1代種子發(fā)芽后通過除草劑篩選獲得抗性轉(zhuǎn)基因植株,進(jìn)一步對(duì)這些植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證,其陽(yáng)性率高達(dá)72.7%。該研究能進(jìn)一步提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率,實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜更有效的遺傳轉(zhuǎn)化。
關(guān)鍵詞:甘藍(lán)型油菜;浸花法;柱頭開口;轉(zhuǎn)化效率;農(nóng)桿菌
中圖分類號(hào): S634.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2019)18-0114-03
收稿日期:2018-06-30
基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(編號(hào):2016YFD0100305)。
作者簡(jiǎn)介:王寧寧(1991—),男,山東濟(jì)南人,碩士研究生,研究方向?yàn)楦仕{(lán)型油菜功能基因組學(xué)。E-mail:wnn517tdx@163.com。
通信作者:譚小力,博士,研究員,研究方向?yàn)橹参锛?xì)胞中油脂合成代謝調(diào)控的關(guān)鍵因子和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、多倍體植物功能基因組研究策略的建立、外源基因在植物中高水平表達(dá)及合成生物學(xué)平臺(tái)的構(gòu)建。E-mail:xltan@ujs.edu.cn。
油菜是四大油料作物之一,位居全球五大經(jīng)濟(jì)作物之列,是食用植物油和蛋白的重要來(lái)源。在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究中,科研人員越來(lái)越青睞應(yīng)用基因工程改良油菜品種,隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,用于外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法越來(lái)越多,大體可分成2類:一類是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法;另一類是外源基因直接導(dǎo)入法,如基因槍法、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法、電擊法、激光微束穿刺法、顯微注射法和花粉管通道法等[1-5]。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中運(yùn)用得最多。1985年,Horsch首次利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜[6]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化是由真空滲透(vacuum infiltration in planta)轉(zhuǎn)化法[7-8]簡(jiǎn)化而來(lái)的[9-10],只需將植株的花序浸泡在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中幾分鐘,然后等種子成熟后即可通過篩選得到轉(zhuǎn)基因的種子[11]。付紹紅等在對(duì)甘藍(lán)型油菜進(jìn)行浸花法轉(zhuǎn)化后,通過GUS(-葡萄糖苷酸酶)和GFP(綠色熒光蛋白)報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)化植株未受傷的葉片表面、子房表皮、蜜腺、柱頭均檢測(cè)到GUS活性或GFP蛋白表達(dá)[12]。這說明農(nóng)桿菌有可能通過以上部位進(jìn)入受體植株細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化過程。之前的研究表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化主要侵染的是雌蕊而不是雄蕊,雌蕊中的胚珠是轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞[13]。之前的研究發(fā)現(xiàn),擬南芥的子房室不總是關(guān)閉,卵細(xì)胞發(fā)育突出,會(huì)延伸成瓶狀結(jié)構(gòu)并在頂部開口,花發(fā)育后期子房室頂部閉合。轉(zhuǎn)化一般在花開放前5~10 d進(jìn)行,此時(shí)雌蕊開放,農(nóng)桿菌得以進(jìn)入子房并將T-DNA轉(zhuǎn)移到卵細(xì)胞[14]。油菜的發(fā)育與擬南芥類似,胚珠在最初發(fā)育階段,先形成1個(gè)細(xì)胞環(huán),進(jìn)而形成1個(gè)頂端開口的瓶狀結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)的頂端約在開花前3 d形成柱頭,隨后頂端開口閉合,在此之前轉(zhuǎn)化都有可能發(fā)生[15]。花開放后短時(shí)間內(nèi)即完成授粉受精過程且柱頭頂端已經(jīng)閉合,此時(shí)的雌蕊已不適合進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)往往選擇未開放的花蕾。本研究中,筆者通過對(duì)未開放花的雌蕊柱頭開裂時(shí)間的研究,探究了農(nóng)桿菌進(jìn)入雌蕊子房室的最佳時(shí)間,從而能進(jìn)一步提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率,實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜更有效的遺傳轉(zhuǎn)化。
1?材料與方法
1.1?材料
以甘藍(lán)型油菜中雙11為研究材料,材料由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。含有攜帶Bar基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌,菌種由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)時(shí)間:2018年4月;試驗(yàn)地點(diǎn):江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院油菜試驗(yàn)田。
1.2?方法
1.2.1?雌蕊的固定及觀察
取正常生長(zhǎng)的油菜開花期待開放的花蕾,從靠近已開放花朵的第1個(gè)花蕾開始,由下至頂端依次取樣并編號(hào),將未開放的第1個(gè)花蕾命名為01號(hào),第2個(gè)花蕾命名為02號(hào),依次往上取樣(對(duì)應(yīng)的雄蕊編號(hào)分別為C01、C02……)。將花萼、花瓣及雄蕊去除,測(cè)量雌蕊長(zhǎng)度并記錄,然后將雌蕊置于福爾馬林-醋酸-乙醇(FAA)固定液中[16],于4 ℃固定24 h。固定好后用掃描電鏡觀察柱頭開口時(shí)間的差異情況。
1.2.2?農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化油菜
將含有攜帶Bar基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌通過浸花法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜中雙11。浸花前將已開放的花剪掉,保留10~15個(gè)待開放的花蕾用于浸花,將其余幼嫩的花蕾剪掉。將攜帶轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌接種于250 mL LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)至D600 nm為0.8~1.0左右,離心后用250 mL MS液體培養(yǎng)基重懸,并加入乙酰丁香酮、6- 芐氨基腺嘌呤(6-BA)及SilwetL-77。將花蕾浸入農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡5 min,浸花完成后套上羊皮紙帶,花期結(jié)束后摘掉紙袋。待種子成熟后收獲、儲(chǔ)存[17]。
1.2.3?陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株的篩選
用于轉(zhuǎn)化的載體上攜帶有1個(gè)抗除草劑的篩選標(biāo)記基因Bar,如圖1所示,因而可以利用除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的篩選。將浸花后收獲的T1代油菜種子播種于托盤中,待幼苗長(zhǎng)出1張真葉時(shí)通過噴灑除草劑篩選出陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化株[18]。提取除草劑篩選后存活下來(lái)的油菜幼苗葉片基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證,PCR擴(kuò)增片段位置如圖1所示,PCR擴(kuò)增的引物序列如下:
Bar-F:5′-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAAA-3′;
Bar-R:5′-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3′。
2?結(jié)果與分析
2.1?柱頭開裂情況觀察
利用掃描電鏡對(duì)FAA固定的甘藍(lán)型油菜雌蕊柱頭進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)并不是所有未開放花蕾的雌蕊柱頭都是開口的,如圖2所示,在所有掃描的雌蕊柱頭中,只有編號(hào)靠前的10個(gè)左右的柱頭是開口的,即最接近開放的10朵左右的花蕾柱頭是開口的,這一部分花蕾在進(jìn)行農(nóng)桿菌浸花時(shí),農(nóng)桿菌最有可能通過柱頭上的開口進(jìn)入子房?jī)?nèi)部,進(jìn)而完成轉(zhuǎn)化。
如圖3所示,通過對(duì)雌蕊長(zhǎng)度的測(cè)量,可以發(fā)現(xiàn)柱頭開口的這一部分(C01~C12)雌蕊較其他雌蕊長(zhǎng)度略長(zhǎng),發(fā)育較早,距離開花的時(shí)間也相對(duì)較短,便于進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
2.2?陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株的篩選
對(duì)浸花法轉(zhuǎn)化得到的油菜種子萌發(fā)后的幼苗噴灑除草劑處理,部分油菜幼苗存活了下來(lái),如圖4所示。由于進(jìn)行轉(zhuǎn)化的載體上含有除草劑抗性基因Bar,其轉(zhuǎn)基因植株對(duì)除草劑具有一定程度的抗性。因此這部分存活下來(lái)的油菜幼苗很有可能是轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因植株。
2.3?陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株的分子鑒定
提取存活油菜幼苗的葉片基因組,PCR擴(kuò)增Bar基因(圖1)中444 bp的片段,由此來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證存活的幼苗是否為轉(zhuǎn)基因植株。如圖5所示,存活植株中有很大一部分都擴(kuò)增出了與質(zhì)粒對(duì)照相同大小的條帶,說明這部分植株確實(shí)為轉(zhuǎn)基因植株,存活植株的陽(yáng)性率約為72.7%。以上結(jié)果表明,對(duì)柱頭開口時(shí)間的正確把握,對(duì)于提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要作用。
3?討論
隨著甘藍(lán)型油菜研究的不斷深入,建立一種高效、便捷的油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系是非常有必要的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法是一種簡(jiǎn)便、快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化法,對(duì)于甘藍(lán)型油菜的研究具有重要意義,已經(jīng)應(yīng)用到了油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中[19-22],但在實(shí)際應(yīng)用中存在的各種因素導(dǎo)致油菜轉(zhuǎn)化效率非常低。本試驗(yàn)通過掃描電鏡,對(duì)油菜雌蕊柱頭的開口時(shí)間進(jìn)行了觀察,發(fā)現(xiàn)并不是所有未開放花蕾的雌蕊柱頭都是開口的,只有最接近開放的10~15個(gè)的花蕾柱頭是開口的。這一部分花蕾在進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染時(shí),由于雌蕊頂端有開口,便于農(nóng)桿菌進(jìn)入子房?jī)?nèi)部,進(jìn)而完成轉(zhuǎn)化。對(duì)浸花法獲得的油菜種子萌發(fā)后的幼苗進(jìn)行除草劑篩選及PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)存活下來(lái)的油菜幼苗為轉(zhuǎn)基因植株的比例達(dá)到72.7%,這一結(jié)果也證實(shí)了該方法的可靠性,即通過正確把握油菜雌蕊的開口時(shí)間,選擇最恰當(dāng)?shù)挠筒嘶ɡ龠M(jìn)行浸花轉(zhuǎn)化,將會(huì)大大提高油菜的遺傳轉(zhuǎn)化效率,對(duì)甘藍(lán)型油菜的研究具有重要意義。
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