劉文英 田宏先 王潤梅 周鳳 劉建霞 劉麗珍

摘要：以AnHRGP基因編碼的富含羥基脯氨酸糖蛋白（AnHRGP）為研究對象，用生物信息學(xué)方法對該蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、親疏水性、二級結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)、三級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等進(jìn)行分析。應(yīng)用ExPASy在線分析AnHRGP的氨基酸組成及理化性質(zhì)，通過SOMPA在線預(yù)測AnHRGP的二級結(jié)構(gòu)，應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0對AnHRGP進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，采用Phyre2對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模。結(jié)果表明，該蛋白基因的開放閱讀框（openreadingframe，簡稱ORF）可以編碼202個氨基酸，是一種無信號肽、無跨膜結(jié)構(gòu)、無卷曲螺旋結(jié)構(gòu)、定位于葉綠體和線粒體基質(zhì)空間的不溶性疏水蛋白。無規(guī)則卷曲為AnHRGP中成分最多的二級結(jié)構(gòu)。通過Phyre2工具模擬出了該蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)模型。

關(guān)鍵詞：莜麥;富含羥基脯氨酸糖蛋白;生物信息學(xué)方法;基因序列;氨基酸序列;微觀分析;立體結(jié)構(gòu);基因功能

中圖分類號： S512.601文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0075-04

收稿日期：2018-06-09

基金項目：山西省基礎(chǔ)研究項目（編號：2015021149）;山西省高?？萍紕?chuàng)新項目（編號：2013142）;山西省大同市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)研究項目（編號：2017082）。

作者簡介：劉文英（1981—），女，山西大同人，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：15035246759@163.com。

富含羥基脯氨酸糖蛋白（hydroxyproline-rich glycoprotein，簡稱HRGP）大約由300個氨基酸殘基組成，羥脯氨酸是其蛋白質(zhì)氨基酸的主要成分，此外其還含有大量的絲氨酸等[1]。富含羥基脯氨酸糖蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在許多植物細(xì)胞壁中已被發(fā)現(xiàn)，聚集為伸展蛋白的形態(tài)[2]。莜麥在我國主要分布于華北、西北等高寒地區(qū)[3]，這些地區(qū)的溫度很容易降低到普通植物難以承受的范圍，當(dāng)溫度發(fā)生劇烈變化或達(dá)到一定程度時，周圍環(huán)境所發(fā)生的變化會對莜麥造成強(qiáng)烈的損傷，而由HRGP聚集而成的伸展蛋白的結(jié)構(gòu)特性可為其抵抗逆變功能提供幫助，該蛋白是對植物起保護(hù)作用的關(guān)鍵因素，能增強(qiáng)植物抗機(jī)械損傷、抗寒、抗病變的能力[4]。

莜麥為禾本科燕麥屬植物，具有與燕麥極度相似的生長要求。在莜麥的生長過程中，HRGP發(fā)揮著重要作用。HRGP會定位在細(xì)胞組織特定位點(diǎn)，從而發(fā)揮一定的功能。目前研究顯示，小麥和燕麥?zhǔn)荋RGP基因表達(dá)較為廣泛的2類單子葉植物[5]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法并對AnHRGP（莜麥HRGP）基因序列進(jìn)行微觀分析，并對AnHRGP肽鏈中的氨基酸序列及立體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測分析，以期為更深層次研究AnHRGP的功能奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

AnHRGP基因序列如圖1所示。通過NCBI-ORF、Protparam、SOMPA、Phyre2等在線分析網(wǎng)站（表1），預(yù)測分析AnHRGP基因的一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)等。本研究于2017年在山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室完成。具體分析方法：利用NCBI-ORF finder分析AnHRGP基因序列，并得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列，應(yīng)用Protparam工具分析AnHRGP的氨基酸組成及理化性質(zhì)[6];利用SignalP 4.1 Server預(yù)測該蛋白質(zhì)是否含有信號肽，進(jìn)而確定其是否為分泌型蛋白[7];應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0對AnHRGP進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，若無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)且氨基酸序列總體在膜外則說明該蛋白質(zhì)為非跨膜蛋白[8];利用PSORT對AnHRGP進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位，測定該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布[9];通過SOMPA在線預(yù)測程序?qū)nHRGP進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并確定構(gòu)成其二級結(jié)構(gòu)的主要元件[10];運(yùn)用PROSITE進(jìn)行蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)分析;通過ExPASy COILS程序在線分析預(yù)測AnHRGP的卷曲螺旋域，以確定其是否具有卷曲螺旋域[11];通過CD search工具對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測;應(yīng)用相應(yīng)的蛋白質(zhì)三級建模方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行建模[12]。

2?結(jié)果與分析

2.1?AnHRGP的一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

通過NCBI-ORF finder分析AnHRGP基因序列，得到相蛋白質(zhì)氨基酸序列（圖2），共包含13個可能的開放閱讀框（openreadingframe，簡稱ORF），其中表達(dá)最為完整的ORF對應(yīng)的氨基酸序列即為AnHRGP基因序列編碼的蛋白質(zhì)序列。運(yùn)用Protparam工具分析AnHRGP的氨基酸組成及理化性質(zhì)得到，AnHRGP由202個氨基酸組成（表2），其中占比例最多的是Pro（19.8%），最少的是Lys（0.5%）;蛋白質(zhì)分子式為C956H1 514N292O262S21，總原子數(shù)為3 045，相對分子質(zhì)量為21 963.60;負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為6個，正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為25個，理論等電點(diǎn)（pI）為9.85，為堿性;在280 nm波長處，AnHRGP的消光系數(shù)為18 085 L/（mol·cm）（假設(shè)所有半胱氨酸均來自胱氨酸）或16 960 L/（mol·cm）（假設(shè)無半胱氨酸殘基存在）;不穩(wěn)定系數(shù)為94.75（>40），預(yù)測為AnHRGP為不穩(wěn)定蛋白;脂肪系數(shù)為55.15;總平均親水性為0.307（>0），預(yù)測顯示，AnHRGP為疏水蛋白。

2.2?AnHRGP的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測及亞細(xì)胞定位

SignalP 4.1 server是一個信號肽預(yù)測的在線軟件，主要用于預(yù)測給定氨基酸中是否含有信號肽。用SignalP 4.1 server信號肽預(yù)測工具對AnHRGP進(jìn)行在線預(yù)測，結(jié)果（圖3）顯示，原始剪切位點(diǎn)分值（C-score）和被結(jié)合剪切位點(diǎn)分值（Y-score）均為0.118，信號肽分值（S-score）為0.190，所有分值都不超過0.2，表明AnHRGP不含信號肽，屬于非分泌型蛋白，并且可以推測在細(xì)胞內(nèi)該蛋白不進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。

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