葉娟，吳杰，王德龍，劉源振，徐春梅,*，薛承斌，孫宇輝

(1 華中科技大學醫(yī)院藥劑科， 湖北 武漢 430074;2 武漢大學人民醫(yī)院藥學部， 湖北 武漢 430060;3 武漢大學藥學院， 武漢 430071)

到目前為止，有三分之二微生物的活性天然藥物來源于放線菌，其中鏈霉菌屬種就生產(chǎn)了約7600種天然藥物，約占所有放線菌的74 %，包括臨床使用的多種抗生素和抗腫瘤藥物，發(fā)揮著重要的臨床作用[1]。微生物來源的次生代謝產(chǎn)物是一類結(jié)構(gòu)多樣，活性顯著的天然化合物，是作為篩選和發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物的天然來源之一，是開發(fā)研究抗腫瘤新藥的研究熱點。蔣忠科等對具有血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2胞內(nèi)酪氨酸激酶(VEGFR2—CD)抑制活性的鏈霉菌106A-0330次生代謝產(chǎn)物進行分離純化，得到兩個二酮哌嗪類化合物，均對VEGFR2—CD有一定的抑制活性[2]。謝春蘭等從海洋放線菌Nocardiopsissp. SCSIO 11492次級代謝產(chǎn)物抗腫瘤活性研究，其中化合物1-棕櫚酰-3-β-D-半乳糖甘油酯(5)對小鼠白血病細胞RAW264.7 IC50為10.9 μmol/L[3]。關(guān)永強等采用一株菌多種次級代謝產(chǎn)物方法，通過對Streptomyces roseofulvusM63 采用4種發(fā)酵方式獲得其次級代謝產(chǎn)物，腫瘤活性研究表明化合物5-(2-甲基苯基)-4-戊烯酸對子宮頸癌細胞(HeLa)、卵巢癌細胞( SKOV3)在24 h時IC50分別為38.26 μmol/L和14.25 μmol/L；(5-羥基-2-氧代-2H-吡喃-4-基) 乙酸甲酯 對子宮頸癌細胞(HeLa) 、卵巢癌細胞(SKOV3)在72h時IC50分別為6.524 μmol/L和5.671 μmol/L[4]。

本文對壯觀鏈霉菌 CCTCC M2017417 次級代謝產(chǎn)物進行了抗腫瘤活性的初步研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈工作臺(蘇州空氣凈化技術(shù)有限公司)；2424-2型二氧化碳培養(yǎng)箱(波蘭Shel-Lab公司)；IX51倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 株式會社)；Model 680型酶標儀(美國BIO-RAD公司)；Bs210s型電子天平(德國 Sartorius 公司)；2-5型及3-18K型離心機(美國Sigma公司)；可調(diào)式微量加樣槍、8通道可調(diào)式微量加樣槍(美國Gilson公司)；96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning Incorporated公司)；超低溫冰箱(中國Haier公司)；電熱恒溫干燥箱(德國memmert (美而特) 公司)；Agilent 6210 LC/MSD TOF 質(zhì)譜儀；BRUKER AV-400型核磁共振儀；分析型與半制備型高效液相色譜儀Agilent 1200色譜儀(四元泵、紫外檢測器及配套色譜工作站)。

1.2 藥品與試劑

RPMI 1640, F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；鏈霉素、青霉素(美國Gibco公司)；PBS緩沖鹽粉末(美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，噻唑藍)(美國Sigma 公司)；二甲基亞砜(DMSO))(美國Sigma 公司)；柱層析用硅膠 100-200目、200-300目，300-400目(青島海洋化工廠)；硅膠GF254薄層預(yù)制板(煙臺化學工業(yè)研究所)；Sephadex LH-20(Amersham Biosciences公司)；氘代試劑(美國CIL公司)；色譜純甲醇、色譜乙腈(迪科馬公司)；水為HPLC級蒸餾水；其他試劑為分析純試劑。

1.3 細菌與細胞

壯觀鏈霉菌(Streptomyces spectabilis)CCTCC M2017417從武漢大學土壤中分離篩選出。通過16S rRNA 基因測序表明其與Streptomyces spectabilisNBRC13424T存在99.4 % 相似度[5]。

MCF7人乳腺癌細胞株，MCG803人胃腺癌細胞株由湖北中醫(yī)藥大學藥學院提供。

2 方法

2.1 Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417細菌培養(yǎng)、次生代謝產(chǎn)物的提取分離

SFM培養(yǎng)基： 33 g黃豆餅粉溶于1000 mL自來水中，煮沸3 h，過濾后取上清液，分別加入甘露醇 20 g和瓊脂 20 g，用蒸餾水定容至1000 mL后分裝，于115 ℃滅菌30 min。

將Streptomyces spectabilisCCTCC M2017417細菌接種在SFM培養(yǎng)皿中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，收集大約50個培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基，分別用環(huán)己烷，氯仿，乙酸乙酯提取次生代謝產(chǎn)物，并進行抗腫瘤活性評價。取活性最強的氯仿部位4.42 g，經(jīng)硅膠柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，半制備液相(乙腈：水=40:100)分離得到化合物1。

2.2 實驗樣品溶液的配制

精確稱取環(huán)己烷部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位，加入 DMSO溶解，搖勻，配成濃度50 mg/mL的樣品溶液；精確稱取化合物1，加入 DMSO溶解，搖勻，配成濃度50 mmol/L的樣品溶液，臨用時用緩沖液稀釋備用。

2.3 乳腺癌細胞與胃腺癌細胞增殖抑制實驗

2.3.1 主要試劑配制

RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基臨用前加10 %的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和鏈霉素。

四甲基偶氮唑鹽(MTT，噻唑藍)溶液配制使用PBS配制成5 mg/mL 的溶液，用0.22 μm的微孔濾膜除菌，分裝，4 ℃避光保存，兩周內(nèi)有效。

2.3.2 細胞培養(yǎng)

MCF7人乳腺癌細胞株，MCG803人胃腺癌細胞株(用含體積分數(shù)10 %的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng))。

2.3.3 MCF7人乳腺癌細胞株、MCG803人胃腺癌細胞株增殖抑制實驗

采用MTT(噻唑藍)法分析環(huán)己烷部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和化合物1的體外抗乳腺癌和胃腺癌活性。實驗步驟如下：

分別取對數(shù)生長期的細胞株，胰酶消化，計數(shù)，將細胞懸液稀釋成每毫升3～5×104個細胞，接種入96孔板中，135 μL每孔。

分別加入不同濃度樣品溶液15 μL；對照組加入含等量DMSO的PBS溶液。每組設(shè)3個平行孔，置于5%CO2，37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

實驗中止前4 h每孔加入5 mg/mL MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄去培養(yǎng)液上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩，使結(jié)晶溶解。

在酶聯(lián)檢測器上檢測570 nm波長下每孔的OD值，取每三孔OD值均數(shù)，按下面的公式求出生長抑制率。結(jié)果用SPSS 17.0軟件處理，求出半數(shù)抑制濃度IC50。

腫瘤細胞生長抑制率%=(OD 對照-OD 樣品)/OD對照×100%

2.4 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差(`c±s)表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 化合物1結(jié)構(gòu)鑒定

黃色粉末，HR-ESI-MS m/z：770.3359[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ14.2(1H，S)、9.32 (1H，S)、7.17 (1H，d，J=8 Hz)、6.28 (1H，t，J=8 Hz)、6.09 (1H，d，J=4 Hz)、5.65(1H，S)、5.53 (1H，t，J=8 Hz)、5.24 (1H，d，J=4 Hz)、4.98 (1H，d，J=4 Hz)、4.86 (1H，d，J=8 Hz)、4.48 (1H，S)、4.35 (1H，d，J=4 Hz)、3.96(1H，t，J=4，8 Hz)、3.75 (1H，d，J=4 Hz)、3.69(1H，m)、3.62 (1H，dd，J=4，0.8 Hz)、3.53 (3H，S)、3.26 (1H，dd，J=4，4 Hz)、3.07 (1H，m)、2.93(1H，dd，J=8，4 Hz)、2.27 (3H，S)、2.23 (3H，d，J=0.8 Hz)、1.87 (3H，d，J=4 Hz)、1.86 (3H，S)、1.85(3H，S)、1.79 (1H，dd，J=4，4 Hz)、1.62(1H，t，J=4 Hz)、1.18 (3H，d，J=4 Hz)、1.18 (3H，S)、0.71 (3H，d，J=4 Hz)、-0.11 (3H，d，J=8 Hz)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ187.0、172.8、170.9、170.1、168.6、160.0、154.2、145.2、143.6、136.4、135.5、131.5、130.0、129.8、123.6、123.5、123.4、112.8、105.5、100.1、89.9、81.4、76.2、75.2、74.2、69.8、53.1、51.0、38.1、37.4、33.6、29.2、21.7、21.2、18.3、14.6、13.2、13.0、10.2、7.7。與文獻[6]報道一致，化合物1為曲張鏈菌素C(Streptovaricin C)，結(jié)構(gòu)見圖1，MS、NMR圖譜見圖2、3、4。

3.2 Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 次級代謝產(chǎn)物抗腫瘤活性

Streptomyces spectabilisCCTCC M2017417 次級代謝產(chǎn)物對乳腺癌細胞MCF7，胃腺癌細胞MCG803的IC50見表1。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)

圖2 化合物1 HR-ESI-MS 圖譜

圖3 化合物1 1H-NMR 圖譜

圖4 化合物1 13C-NMR 圖譜

表1 Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 次級代謝產(chǎn)物IC50 (72 h，n=3)

4 討論

研究表明曲張鏈菌素類化合物具有抗白血病作用，其作用機制是阻斷DNA聚合酶與病毒模板RNA結(jié)合而抑制病毒的反轉(zhuǎn)錄。曲張鏈菌素C衍生物抗白血病活性比曲張鏈菌素C強2～10倍，且毒性低[7]。Kramarsky等[8]研究表明曲張鏈菌素對小鼠乳腺腫瘤的生長和新發(fā)腫瘤均有明顯的抑制作用。胡海峰[9]等從鏈霉菌SIPI 97～84的次級代謝產(chǎn)物中分離得到化合物曲張鏈菌素C (Streptovaricin C)和曲張鏈菌素G(Streptovaricin G)，其中曲張鏈菌素C (Streptovaricin C)具有中度強度的免疫抑制活性。Liu等對細胞色素P450基因參與Streptovaricin類化合物生物合成功能進行了分析，且Streptovaricin類化合物及衍生物具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)生物活性[5]。曲張鏈菌素類化合物毒性較大，限制其使用[7,10]，當日劑量大于100 mg時，小鼠死亡率即大于20 %[11]。

本文對壯觀鏈霉菌 CCTCC M2017417 次級代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部位、氯仿部位、環(huán)己烷部位分別進行抗MCF7人乳腺癌細胞株和MCG803人胃腺癌細胞株活性篩選，其氯仿部位對MCF7人乳腺癌細胞株抑制活性最強，因此對次級代謝產(chǎn)物的氯仿部位進行化合物的分離，得到化合物1，經(jīng)鑒定為曲張鏈菌素C (Streptovaricin C)，屬于安莎類抗生素[7]。化合物1對MCF7人乳腺癌細胞株和MCG803人胃腺癌細胞株IC50分別為14 μmol/L和0.001 μmol/L，具有較強的抗腫瘤活性。本文首次報道曲張鏈菌素C對胃癌的抗腫瘤活性，且活性極強，其作用機制有待進一步研究。